AlCl3促進毛竹低共熔體系預(yù)處理效率的研究

程金元， 詹云妮， 黃 晨,2， 鄧擁軍,2， 房桂干,2*

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室;國家林業(yè)和 草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室,江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)

隨著世界經(jīng)濟的不斷發(fā)展，社會對能源的需求越來越大，由此引發(fā)的能源短缺和環(huán)境污染等問題日趨嚴重，迫使人類尋求一種清潔、可再生的新型能源[1-3]。木質(zhì)纖維生物質(zhì)是地球上儲量最為豐富的可再生資源，利用木質(zhì)纖維原料制備燃料乙醇是生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化的重要方式，同時也是解決能源危機和環(huán)境污染問題的途徑之一[4]。木質(zhì)纖維原料制備燃料乙醇主要包含預(yù)處理、酶水解和發(fā)酵等關(guān)鍵步驟。木質(zhì)纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，其中半纖維素和木質(zhì)素緊密包裹纖維素，形成制約纖維素發(fā)酵的天然屏障，使得纖維素難以被有效地發(fā)酵[5]，因此，對木質(zhì)纖維生物質(zhì)進行生物煉制，首先需要進行預(yù)處理。常用的預(yù)處理方法有物理法、化學法、生物法等，化學法是目前最為常用的預(yù)處理技術(shù)，通過化學藥劑處理木質(zhì)纖維原料以實現(xiàn)木質(zhì)纖維原料中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等組分的有效分離，提高預(yù)處理底物的纖維素可及性，但化學法預(yù)處理存在反應(yīng)溫度高、化學品回收難、污染嚴重等問題，限制了其大規(guī)模應(yīng)用，亟需尋求一種清潔、可回收的預(yù)處理溶劑[6]。低共熔溶劑(DES)作為一種環(huán)保、價格低廉、易制備、熱穩(wěn)定性好、可循環(huán)使用的綠色溶劑，近年來逐漸成為研究熱點，其可以在較低溫度下有效實現(xiàn)纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的分離，大幅提高預(yù)處理物料發(fā)酵效率[7]。DES體系能夠與木質(zhì)纖維素組分形成強分子間氫鍵作用，從而競爭木質(zhì)纖維原料自身的氫鍵，實現(xiàn)木質(zhì)纖維原料組分分離[8]。DES體系由氫鍵供體和氫鍵受體組成，其中氫鍵受體主要有氯化膽堿、脯氨酸、甜菜堿等;常用的氫鍵供體包括多元醇(乙二醇、甘油等)，有機酸(乳酸、草酸等)，氨基化合物(尿素、氨基酸等)和酚類化合物(香蘭素、對香豆酸等)等。近年來，科學界逐漸形成共識，即采用木質(zhì)纖維原料來源的化合物(愈創(chuàng)木酚等)作為DES的氫鍵供體，可實現(xiàn)資源循環(huán)利用和可持續(xù)發(fā)展。生物基來源的乳酸、草酸等制備的DES體系對生物質(zhì)預(yù)處理已有較好的效果，但在有機醇類(甘油、乙二醇等)及部分木質(zhì)素衍生物類(香草醛、對羥基苯甲酸等)等供氫較弱的體系中，形成的DES對木質(zhì)纖維原料的處理效果較差。本研究采用的氫鍵供體為愈創(chuàng)木酚，由于愈創(chuàng)木酚供氫能力弱，氯化膽堿和愈創(chuàng)木酚形成的DES體系對毛竹的預(yù)處理效果較差，向該DES體系中添加微量AlCl3,探討了AlCl3對DES體系的促進機制，以期為木質(zhì)纖維素基DES體系的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛竹由浙江仙鶴紙業(yè)有限公司提供，毛竹的主要組成(質(zhì)量分數(shù)計)：葡聚糖41.00%，木聚糖12.78%，木質(zhì)素30.99%，乙醇抽出物1.12%。纖維素酶(諾維信CTec 2)和木聚糖酶(諾維信X 2753)均購于Sigma-Aldrich(上海)公司，實測酶活力分別為250 FPU/g和3 490 U/g。AlCl3、氯化膽堿和愈創(chuàng)木酚，均為市售分析純。

1.2 AlCl3輔助的低共熔溶劑預(yù)處理

毛竹竹片首先在自來水中浸泡過夜，浸泡后的竹片用雙螺桿擠壓機擠壓后，再用GNM300盤磨機進行盤磨處理，盤磨間隙為0.2 mm，盤磨得到的竹纖維長度約為0.5～2 mm，盤磨后的原料經(jīng)自然風干后測定水分并于密封袋中密封保存，備用。

AlCl3輔助的低共熔溶劑(DES)的制備在80 ℃油浴鍋中進行，DES總質(zhì)量為100 g。按不同物質(zhì)的量(n氯化膽堿∶n愈創(chuàng)木酚∶nAlCl3為25 ∶50 ∶1、 25 ∶50 ∶0.8、 25 ∶50 ∶0.4、 25 ∶50 ∶0.2和25 ∶50 ∶0)稱取氯化膽堿、愈創(chuàng)木酚和AlCl3至250 mL三角燒瓶中，于80 ℃油浴中不斷攪拌，直至體系為澄清、透明狀液體，經(jīng)換算溶劑體系中AlCl3用量(摩爾分數(shù)，下同)為1.32%、 1.06%、 0.53%、 0。

準確稱取相當于絕干10 g的風干毛竹(含水量10.24%)11.14 g于上述三角燒瓶中，將三口燒瓶轉(zhuǎn)入至110 ℃油浴鍋中攪拌反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后，將三角燒瓶從油浴鍋中取出，反應(yīng)混合物倒入250 mL丙酮水溶液(體積比1 ∶1)中終止反應(yīng)，然后置于磁力攪拌器上攪拌4 h，再采用布氏漏斗進行固液分離，所得預(yù)處理物料(固液分離后含纖維素的固形物)置于4 ℃冰箱中儲存、備用。

1.3 酶水解

稱取相當于絕干0.5 g預(yù)處理物料于150 mL酶解瓶中，加入0.1 mL吐溫80和0.04 mL 10 g/L四環(huán)素溶液，同時加入1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL，調(diào)節(jié)體系pH值至4.8左右。分別按酶用量25 FPU/g(以葡聚糖質(zhì)量計)和150 U/g(以木聚糖質(zhì)量計)加入纖維素酶和木聚糖酶，并補充適量去離子水使反應(yīng)體系體積為20 mL。將酶解瓶置于50 ℃和150 r/min的搖床中反應(yīng)72 h。酶水解結(jié)束后，取1 mL酶解樣品沸水中高溫滅活3 min，而后于10 000 r/min條件下離心5 min，取上清液測定其中的葡萄糖濃度。預(yù)處理物料葡聚糖酶水解得率按公式(1)計算：

yc=m1×0.9/m2×100%

(1)

式中：yc—葡聚糖酶水解得率，%；m1—水解液中葡萄糖質(zhì)量，g；m2—酶水解初始底物中葡聚糖質(zhì)量，g。

1.4 分析方法

1.4.1毛竹化學組分分析 實驗中物料葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素(酸溶木質(zhì)素和酸不溶木質(zhì)素之和)質(zhì)量分數(shù)均采用美國可再生能源實驗室的標準方法測定[9]。

1.4.2物料得率和化學組分回收率分析 物料得率和組分回收率按式(2)和式(3)計算：

y=m3/m4×100%

(2)

r=m5/m6×100%

(3)

式中:y—物料得率，%；m3—預(yù)處理后物料質(zhì)量，g；m4—初始物料質(zhì)量，g；r—化學組分回收率，%；m5—預(yù)處理后物料中剩余各組分質(zhì)量，g；m6—初始物料中各組分質(zhì)量，g。

1.4.3單糖含量的測定 葡萄糖和木糖等可發(fā)酵糖濃度均采用Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)測定，色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱，柱溫55 ℃，進樣量10 μL；流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液、流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度35 ℃。

1.4.4X射線衍射(XRD)分析 實驗中樣品的結(jié)晶度采用Advanced D8 X射線衍射儀(德國布魯克公司)測定。儀器采用Cu Kα輻射源為X射線發(fā)射源，入射線波長為0.15 nm，測試過程中電壓40 kV，電流40 mA。X射線發(fā)生器功率為3 kW，衍射角度2θ為10°～40°，掃描速率為2(°)/min，樣品的結(jié)晶度按Segal提出的經(jīng)驗公式(4)計算。

ICr=(I002-Iam)/I002×100%

(4)

式中：I002—002晶格的極大衍射峰強度；Iam—無定形區(qū)背景衍射的散射峰強度。

1.4.5掃描電鏡(SEM)分析 掃描電鏡(SEM)分析前物料需進行冷凍干燥并用E-1010噴頭進行表面噴金處理20 s，物料經(jīng)噴金處理后采用3400-N掃描電鏡(日本Hitachi公司)進行分析，電壓為15 kV。

1.4.6紅外光譜(FT-IR)分析 DES預(yù)處理前后物料的(FT-IR)分析采用TENSOR27紅外光譜儀(德國布魯克公司)進行分析，掃描波數(shù)為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，每個樣本掃描32次。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對毛竹化學組成及回收率的影響

采用供氫能力較弱的愈創(chuàng)木酚作為DES的氫供體，并加入微量AlCl3，實驗設(shè)置5個不同的AlCl3用量梯度。隨著AlCl3用量的增加，預(yù)處理后物料回收率、物料中各成分含量，以及預(yù)處理后物料葡聚糖、木聚糖回收率和木質(zhì)素脫除率如表1所示。

表1 不同AlCl3用量低共熔溶劑預(yù)處理對竹材化學組分的影響Table 1 Effect of the different dosage of AlCl3 in DES on the content of the bamboo components

由表1可知，未添加AlCl3的DES中預(yù)處理物料回收率為95.10%，其中葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素含量與毛竹原料相近，表明氯化膽堿/愈創(chuàng)木酚體系對毛竹預(yù)處理效果不顯著。隨著AlCl3的引入，預(yù)處理效率大幅上升，其中預(yù)處理物料得率從未添加AlCl3時的95.10%下降至57.16%，表明AlCl3用量的增加有利于竹材組分降解，具體表現(xiàn)為預(yù)處理物料葡聚糖、木聚糖、木質(zhì)素含量發(fā)生不同程度的變化[9-10]，其中木聚糖和木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)分別從未添加AlCl3的12.58% 和28.87%降低到2.87%和13.62%，而葡聚糖的質(zhì)量分數(shù)由42.31%增加到68.82%，表明隨著AlCl3用量的增加，毛竹中的木質(zhì)素和半纖維素降解越來越劇烈，而葡聚糖則比較穩(wěn)定。在DES預(yù)處理體系中，未加入AlCl3的體系中形成的氫鍵較弱，不足以競爭木質(zhì)纖維原料間的氫鍵；而AlCl3能夠與氯化膽堿、愈創(chuàng)木酚的DES形成氯離子-金屬陽離子-愈創(chuàng)木酚超分子配合物，增強了DES體系中的氫鍵作用，使木質(zhì)纖維原料組分之間的氫鍵斷裂而發(fā)生分離[11]。

圖1 AlCl3用量對DES體系下 葡聚糖酶解率的影響Fig.1 Effect of AlCl3 dosage on glucan enzymatic hydrolysis yield in DES system

由表1可知，AlCl3用量為0.27%時，相較于未加入AlCl3的體系，木聚糖的回收率迅速降低，由93.65% 降低到31.29%，木質(zhì)素脫除率迅速增加，由11.40%增加到54.39%，表明少量的AlCl3的加入可有效促進木聚糖和木質(zhì)素的降解。隨著AlCl3用量的增加，木聚糖和木質(zhì)素的降解越來越嚴重，當AlCl3用量為1.32%時，木聚糖脫除率和木質(zhì)素脫除率達到最大值，分別為87.16% 和74.88%。而葡聚糖回收率隨著AlCl3用量的增加基本保持不變，始終在95%以上，表明本研究所用DES對纖維素的影響較小，表明氯化膽堿/愈創(chuàng)木酚/AlCl3體系能夠?qū)崿F(xiàn)木聚糖和木質(zhì)素的大量降解，并同時保留幾乎全部葡聚糖[12]。

2.2 預(yù)處理對酶解效果的影響

預(yù)處理物料的酶水解效率是評價預(yù)處理效果的關(guān)鍵指標，對不同AlCl3用量的DES預(yù)處理毛竹進行酶水解，并分析了酶水解得率與木聚糖和木質(zhì)素脫除率的關(guān)系，結(jié)果如圖1和圖2所示。

由圖1可知，未添加AlCl3的DES預(yù)處理竹材葡聚糖酶水解得率較低，僅為11.16%。AlCl3的加入對低共熔溶劑體系有明顯促進作用，當添加少量AlCl3(用量為0.27%)，葡聚糖酶水解得率由11.16% 上升到68.37%，提高了57.21個百分點；隨著AlCl3用量的進一步增加，葡聚糖酶水解得率也隨之增加，當AlCl3用量為1.32%時，葡聚糖酶水解得率達到最大值96.20%，比未添加AlCl3的DES預(yù)處理毛竹增加了近8倍。葡聚糖酶水解得率的提高得益于預(yù)處理過程中木聚糖和木質(zhì)素的去除，提高了纖維素的可及度。進一步研究了酶水解得率與木聚糖和木質(zhì)素脫除率的關(guān)系，如圖2所示，酶水解得率與木聚糖和木質(zhì)素的脫除率均有很強的線性關(guān)系，R2分別為0.98和0.99，表明毛竹中木聚糖和木質(zhì)素的去除均對酶水解有較強促進作用。

圖2 木質(zhì)素脫除率(a)和木聚糖脫除率(b)與酶水解得率的關(guān)系Fig.2 The relationship of lignin(a) and xylan(b) removal with the glucose enzymatic yield

2.3 預(yù)處理前后物料表征分析

2.3.1纖維素結(jié)晶度 為深入了解AlCl3的引入對DES預(yù)處理物料纖維結(jié)構(gòu)的影響，測定了預(yù)處理前后物料纖維素結(jié)晶度，并比較了纖維素結(jié)晶度與葡聚糖酶水解得率的關(guān)系，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 不同AlCl3用量預(yù)處理物料的XRD圖 圖4 葡聚糖酶水解得率與纖維素結(jié)晶度的關(guān)系

由圖3及公式(4)經(jīng)計算可知，毛竹原料的纖維素結(jié)晶度為59.59%，預(yù)處理物料纖維素結(jié)晶度隨著AlCl3用量的提高而顯著增加。未加AlCl3的DES中預(yù)處理后毛竹的結(jié)晶度與原料相近，為58.99%。隨著AlCl3用量從0提高至1.32%，預(yù)處理物料纖維素結(jié)晶度從58.99%提高至61.31%、 61.91%、 62.83%和67.34%，這是因為在DES預(yù)處理過程中，非結(jié)晶態(tài)的木聚糖和木質(zhì)素大量降解，使結(jié)晶區(qū)含量大幅增加[9]。由圖4得出，預(yù)處理后毛竹的結(jié)晶度和酶水解得率存在一定程度的正相關(guān)性，R2為0.60，表明DES預(yù)處理物料纖維素結(jié)晶度并非影響葡聚糖酶水解得率的主要因素。在本研究體系中，葡聚糖酶水解得率的提高主要受木質(zhì)素和半纖維素的脫除的影響，這兩者的去除減少了其對纖維素的附著，增加了纖維素酶與纖維素的結(jié)合位點[13]。

2.3.2SEM分析 采用掃描電子顯微鏡觀察原料及不同的AlCl3用量下的低共熔溶劑預(yù)處理毛竹纖維的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，原料毛竹的纖維較長，表面有少量分絲現(xiàn)象，可能是由于盤磨處理過程中的機械作用所致；與原料相似，未添加AlCl3的預(yù)處理物料纖維仍保持完整，并未發(fā)現(xiàn)明顯變化；當AlCl3用量為0.27% 時，預(yù)處理物料纖維明顯變短，并伴有纖維團聚現(xiàn)象[14-15]，這是因為纖維尺寸的變短以及木質(zhì)素和半纖維素溶出使得纖維的比表面積增大，進而增加了纖維之間的氫鍵結(jié)合[16]。隨著AlCl3用量的繼續(xù)增加，纖維之間的團聚更加明顯，當AlCl3用量為0.53%、 1.06%和1.32%時，SEM圖已看不出單根纖維的存在。由SEM結(jié)果可以得出，預(yù)處理過程中毛竹切斷多，纖維的比表面積增大，酶解過程中的酶結(jié)合位點增多，增加了纖維素酶與纖維素的吸附，進而提高了酶解得率。

a.原料raw material; b.0; c.0.27%; d.0.53%; e.1.06%; f.1.32%圖5 不同AlCl3用量預(yù)處理物料的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of materials pretreated with different AlCl3 dosage

a.原料raw meterial; b.0; c.0.27%; d.0.53%; e.1.06%; f.1.32%圖6 不同AlCl3用量預(yù)處理物料FT-IR圖Fig.6 FT-IR spectra of materials pretreated with different AlCl3 dosage

經(jīng)過DES預(yù)處理的物料，其紅外譜圖(曲線b～f)中1422和1367 cm-1處無明顯變化，說明DES預(yù)處理過程纖維素的降解程度較小。隨著AlCl3用量的增加，纖維素結(jié)晶區(qū)1101 cm-1處信號峰增強，表明纖維素結(jié)晶度增加；LCC吸收峰(1730 cm-1)逐漸減小，并且當AlCl3用量為1.32%時，1730 cm-1處的吸收峰消失，表明半纖維素降解嚴重；木質(zhì)素在1507、 1602和833 cm-1處相關(guān)峰隨著預(yù)處理強度不斷增加，其信號逐漸減弱，說明木質(zhì)素逐漸降解；木質(zhì)素的紫丁香基吸收峰(1320 cm-1)在整個預(yù)處理過程中無明顯變化，而愈創(chuàng)木基峰(1237 cm-1)則隨著AlCl3用量的增加，強度逐漸降低，表明愈創(chuàng)木基有一定程度的減少，說明隨著AlCl3用量的增加愈創(chuàng)木基在DES預(yù)處理過程中較紫丁香基更易于降解。

3 結(jié) 論

3.1DES氯化膽堿/愈創(chuàng)木酚體系對毛竹預(yù)處理無明顯作用，而AlCl3的引入能夠有效促進木聚糖和木質(zhì)素降解，并能保留幾乎全部葡聚糖。當AlCl3的用量從0增加到1.32%，半纖維素回收率從93.65%降低到12.84%，木質(zhì)素脫除率由11.40%增加到74.88%。

3.2隨著木聚糖和木質(zhì)素的脫除，預(yù)處理物料酶水解性能大幅提高。未加AlCl3的DES預(yù)處理物料葡聚糖酶水解得率為11.16%；AlCl3的用量為1.32%時，預(yù)處理物料葡聚糖酶水解得率提高至96.20%，酶水解得率提高近8倍。

3.3經(jīng)XRD、FT-IR和SEM分析可知，纖維素結(jié)晶度并非影響葡聚糖酶水解得率的主要因素，而木質(zhì)素和半纖維素的脫除對其酶解效果影響較大。隨著預(yù)處理強度的增加，纖維素含量增加，半纖維素和木質(zhì)素含量減少，葡聚糖酶解得率和這兩者的脫除率呈較強的線性關(guān)系；當AlCl3的用量從0增加到1.32%，纖維的切斷逐漸增多，團聚現(xiàn)象顯著增強，纖維比表面積增大，纖維素與酶的結(jié)合位點增多，毛竹酶水解得率顯著增加。