Apelin/APJ系統(tǒng)及eNOS在胚胎停育患者絨毛組織中的表達(dá)

梁月帥 馬秀娟 郝曉瑩

近年胚胎停育患者數(shù)量不斷增長(zhǎng)，病因多樣，但是致病機(jī)制尚不明確[1]。當(dāng)前仍然無(wú)有效的預(yù)防措施，探求胚胎停育病因成為熱點(diǎn)。 Chapman Nigel等人[2]研究證實(shí)Apelin及其受體血管緊張素II I型受體相關(guān)蛋白(putative receptor protein related to the angiotenII typel receptor,APJ)系統(tǒng)對(duì)于青蛙和小鼠心臟血管系統(tǒng)的正常發(fā)育是必需的，并且它們的缺失導(dǎo)致大多數(shù)胚胎中的血管破壞。

國(guó)內(nèi)關(guān)于 Apelin/ APJ和胎盤絨毛組織一氧化碳(nitrc oxide，NO)生成關(guān)系的研究較少，且 Apelin/ APJ及內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)在胚胎停育患者絨毛組織中表達(dá)的文獻(xiàn)相對(duì)較少，故本次實(shí)驗(yàn)旨在檢測(cè)正常早孕和胚胎停育絨毛組織的Apelin、其受體 APJ、 eNOS的表達(dá)，其目的在于探討 Apelin、其受體 APJ及 eNOS在胚胎發(fā)育和妊娠維持過程中的作用。

對(duì)象與方法

1. 研究對(duì)象：選取2018年3月—2018年12月于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的20例不明原因早期(停經(jīng)8～9周)胚胎停育患者為研究組，診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)超聲檢查提示妊娠囊在子宮內(nèi)，且小于停經(jīng)天數(shù)，沒有胎芽或者原始的心管搏動(dòng)的病人[3]。選取同期20例正常早期懷孕婦女，要求流產(chǎn)的病人為對(duì)照組，超聲檢查胎兒發(fā)育健康，以往沒有不良孕產(chǎn)史。

所有患者月經(jīng)規(guī)律，3個(gè)月期間未使用性激素類藥物，沒有煙酒嗜好；無(wú)心、腦、代謝及內(nèi)分泌疾患；無(wú)惡性腫瘤史；無(wú)血栓病史；無(wú)外科手術(shù)史；無(wú)嚴(yán)重的心、肝、腎臟功能異常；無(wú)未被控制的糖尿病及高血壓??；無(wú)子宮畸形等引起胚胎停育的誘發(fā)因素。經(jīng)染色體基因檢測(cè)(采用高通量測(cè)序技術(shù))排除染色體問題所致胚胎停止發(fā)育，標(biāo)本采集時(shí)通過山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)，患者均知情并簽署同意書。兩組患者的年齡、停經(jīng)時(shí)間及妊娠次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2. 標(biāo)本采集:人工流產(chǎn)術(shù)后取患者絨毛組織，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)清洗組織，絨毛組織分成兩份，其中一份立即置入10%甲醛溶液中固定，用于石蠟切片的制作和免疫組織化學(xué)研究。另一份用無(wú)菌凍存管迅速置于液氮中，待RNA抽提。

3. 實(shí)驗(yàn)方法:

(1)絨毛組織中Apelin、APJ 及eNOS 蛋白的表達(dá)檢測(cè)。采用免疫組織化學(xué)法，試劑盒購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，兔抗人單克隆抗體Apelin、APJ及eNOS 均為bioswamp 公司產(chǎn)品,工作濃度均為1∶50。結(jié)果判定：Apelin、APJ 及eNOS蛋白均以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性細(xì)胞。通過顯微鏡拍照，每張切片選擇5個(gè)具有代表意義的高倍視野觀察Apelin、APJ及eNOS蛋白的分布及表達(dá)。采用Image J 分析軟件，以平均光密度值表示Apelin、APJ及eNOS蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

(2)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Real-time PCR)檢測(cè)絨毛組織中Apelin、APJ及eNOS mRNA表達(dá)。用Trizol 法提取組織的總RNA，Trizol 購(gòu)自ambion 公司。引物的設(shè)計(jì)Real-time PCR以β-Actin 為內(nèi)參照基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。采用TAKARA 公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。采用KAPA Biosystems 公司的SYBR Green PCR 試劑盒，按說明書操作步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20 uL。本研究以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算Apelin、APJ及eNOS的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參照基因的Ct值，△△Ct=胚胎停育組△Ct-對(duì)照組△Ct。

結(jié)果

1. Apelin、APJ 及eNOS 蛋白在絨毛組織中的表達(dá)：Apelin蛋白在絨毛組織中的表達(dá)部位為絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，陽(yáng)性染色主要位于胞漿。APJ蛋白在絨毛組織的表達(dá)主要位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，陽(yáng)性染色主要位于胞漿。eNOS蛋白在絨毛組織中的表達(dá)部位為絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞，陽(yáng)性染色主要位于胞漿。免疫組化結(jié)果顯示(見圖1)：Apelin蛋白、APJ蛋白和eNOS蛋白在研究組絨毛組織中的表達(dá)低于對(duì)照組絨毛組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 在兩組絨毛組織中Apelin、APJ、eNOS 蛋白的表達(dá)

圖1 兩組絨毛組織中Apelin、APJ、eNOS蛋白的表達(dá)(SP×200)圖A1是Apelin在對(duì)照組絨毛組織中的表達(dá)情況，A2是Apelin在研究組絨毛組織中的表達(dá)情況；圖B1是APJ在對(duì)照組絨毛組織中的表達(dá)情況，B2是APJ在研究組絨毛組織中的表達(dá)情況；圖C1是eNOS在對(duì)照組絨毛組織中的表達(dá)情況，C2是eNOS在研究組絨毛組織中的表達(dá)情況。

2. 絨毛組織中Apelin mRNA、APJ mRNA及eNOS mRNA表達(dá)水平的比較：PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Apelin mRNA、APJ mRNA及eNOS mRNA在兩組絨毛組織中都有表達(dá)，在研究組的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如圖2，3,4所示)。

圖2 兩組絨毛組織中Apelin的相對(duì)表達(dá)量注：***P<0.001

圖3 兩組絨毛組織中APJ的相對(duì)表達(dá)量注：**P<0.01

圖4 兩組絨毛組織中eNOS的相對(duì)表達(dá)量注：* P<0.05

3. 胚胎停育組絨毛組織中Apelin、eNOS表達(dá)的相關(guān)性

Spearson直線相關(guān)分析結(jié)果表明，研究組絨毛組織中Apelin與eNOS的表達(dá)呈弱的正相關(guān)(r=0.26，P=0.048，P<0.05)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

近年來(lái)學(xué)者們[4]發(fā)現(xiàn)早期胚胎發(fā)育與胚胎血管生成密切相關(guān)，血管生成是各種生理過程的中心，如胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、傷口愈合、組織修復(fù)等。目前研究表明Apelin/ APJ及eNOS與胚胎組織中血管的形成有關(guān)系，胎盤血管生成對(duì)胎盤正常的血液循環(huán)及胚胎的發(fā)育極其重要，是胎兒與母體物質(zhì)交換的保證。已有的研究表明：在受精的第19 d早期的胎盤血管生成，它是妊娠初期新生的血管形成最重主要的形式，并且受精的第22 d左右呈現(xiàn)了完整胎兒的毛細(xì)血管網(wǎng)[5]，許多原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的產(chǎn)生與胎盤中血管的增生失去平衡及胎兒的血液供應(yīng)不足有關(guān)。成功的妊娠依賴于胎盤良好的發(fā)育和生長(zhǎng)，在胎盤植入和胎盤形成的過程中，血管的生成對(duì)于成功妊娠是非常關(guān)鍵的。

APJ是一種與血管緊張素1型受體相關(guān)的 G蛋白偶聯(lián)受體，APJ與1型受體血管緊張素 II(AT1a)有強(qiáng)烈的序列同源性，不與血管緊張素 II結(jié)合[6]。 Apelin是一種生物活性肽，最初由Tatemoto等人從牛胃提取物中鑒定。Apelin是由內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的血管生成因子，通過自分泌及旁分泌在自身和相鄰的細(xì)胞起作用。Apelin是APJ的內(nèi)源性配體，Apelin結(jié)合并激活A(yù)PJ 后可以促進(jìn)其功能的發(fā)揮。

Apelin-APJ有重要的生理和病理作用，包括調(diào)節(jié)腫瘤、血管平滑肌細(xì)胞增殖、缺血/再灌注損傷、體液穩(wěn)態(tài)、心血管功能、血管生成。Apelin-APJ刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，人體內(nèi)假設(shè)沒有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子時(shí)，也能刺激血管的萌發(fā)[7]。研究證明大約20%APJ缺失小鼠在胚胎期10.5 d時(shí)在背主動(dòng)脈和卵黃囊脈管系統(tǒng)中具有缺陷，而另外20%的小鼠在妊娠晚期表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)性心臟缺陷和血管平滑肌缺陷[8]。在尿囊中和在胚胎期9.5 d侵入胎盤的脈管系統(tǒng)中有APJ的表達(dá)。因此，Apelin-APJ信號(hào)傳導(dǎo)可在胚外組織以及胚胎組織中起作用，以影響中胚層衍生物的形成，如卵黃囊的脈管系統(tǒng)，造血祖細(xì)胞，絨毛膜及尿囊。本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)在兩組中Apelin-APJ都有表達(dá)，并且在早孕絨毛中分布于絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組患者絨毛組織中其表達(dá)與對(duì)照組相比明顯降低，使胚胎血管的發(fā)育減少，進(jìn)而可能參與胚胎停止發(fā)育的發(fā)生。研究證實(shí)Apelin-APJ系統(tǒng)對(duì)于青蛙和小鼠心臟血管系統(tǒng)的正常發(fā)育是必需的，并且它們的缺失導(dǎo)致大多數(shù)胚胎中的血管破壞[3]?？梢酝茰y(cè)出Apelin-APJ在胎盤的完整血管網(wǎng)形成的階段可能發(fā)揮的功能是必不可少的。eNOS及其產(chǎn)物一氧化氮(NO)調(diào)節(jié)了許多內(nèi)皮細(xì)胞功能，包括血管生成、血管通透性和血管舒縮張力[9]，其參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能在妊娠建立和維持中有重要的作用。NO的合成限速酶是eNOS，其活性的變化導(dǎo)致NO生成的改變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)視網(wǎng)膜血管生成中表明eNOS對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的激活至關(guān)重要[10]，說明eNOS在血管的生成過程中可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管的穩(wěn)定性。動(dòng)物研究證明 eNOS在內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)中有表達(dá)，并且血管母細(xì)胞和胚胎內(nèi)皮細(xì)胞(Embryonic Endothelial cells,EECs)里Ser1177的磷酸化對(duì)NO的調(diào)控有著非常重要作用[11]。在血管發(fā)育的早期階段(在鼠交配后7.2～8.5 d)，eNOS的表達(dá)證實(shí)成血管細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，促進(jìn)血管生成。胚胎血管發(fā)育的初期，eNOS的磷酸化是血管生成因子介導(dǎo)其的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究提示 eNOS活性降低[12]，導(dǎo)致 NO合成障礙，進(jìn)一步使血管損傷后平滑肌細(xì)胞增加，使血管壁內(nèi)膜層增加，血管腔縮小，最終使早期的胚胎停止發(fā)育。本研究提示 eNOS在兩組中都有表達(dá)，且在早孕的絨毛組織中分布于絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中其表達(dá)與對(duì)照組相比明顯降低，使胚胎血管生成減少，進(jìn)而可能參與胚胎停止發(fā)育的發(fā)生。

有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)[13]在心血管系統(tǒng)，Apelin通過激活 eNOS引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞釋放 NO，產(chǎn)生強(qiáng)有力的內(nèi)皮依賴的血管擴(kuò)張作用，給予eNOS抑制劑，發(fā)現(xiàn) Apelin的降低血壓的作用被抑制，提示 NO是apelin發(fā)揮作用的下游信號(hào)因子。Apelin擴(kuò)張動(dòng)脈和靜脈，有血管舒張效應(yīng)，其機(jī)制通過活化血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型eNOS刺激NO的產(chǎn)生和釋放從而舒張血管[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示 Apelin通過結(jié)合并激活 APJ，激活磷酸肌醇3-激酶(PI3 K)[3]，導(dǎo)致 Akt活化，進(jìn)而激活 eNOS使內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，進(jìn)而促進(jìn)胚胎血管生成。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組絨毛組織中 Apelin與eNOS的表達(dá)呈弱的正相關(guān)，由此可以得知，在胚胎早期的發(fā)育過程中Apelin及 eNOS的表達(dá)呈正相關(guān)，說明 Apelin可以促進(jìn) eNOS的生成和發(fā)揮作用?？梢圆聹y(cè)在胚胎發(fā)育早期 Apelin及 eNOS表達(dá)升高可以促使 NO的生成，促進(jìn)了胚胎在宮腔內(nèi)的著床部位血管的擴(kuò)張及通透性的增加，還可促使平滑肌的放松，為妊娠的順利進(jìn)行提供了適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，進(jìn)而促使胚胎的植入。

總之，妊娠是個(gè)既精致細(xì)膩又復(fù)雜多樣的過程，胚胎的早期發(fā)育與胚胎血管生成又聯(lián)系密切，繼續(xù)完善這方面的研究，這將有助于對(duì)胚胎停育的血管相關(guān)因素的認(rèn)識(shí)提供一定的理論依據(jù)。