利用體外替代模型評(píng)價(jià)梔子黃色素的發(fā)育毒性

康陳萍 肖倩倩 劉青云 郝衛(wèi)東

梔子黃(gardenia yellow)，主要成分為藏花素和藏花酸，是以梔子果實(shí)為原料經(jīng)乙醇浸提法提取、純化而成的天然色素[1]。梔子黃色素易溶于水、乙醇等極性溶劑，對(duì)金屬離子、酸、堿和熱等穩(wěn)定，呈鮮艷的黃色，具有較好的著色性能[2-3]。梔子黃色素在中國和日本等亞洲國家已作為食品添加劑廣泛使用。中國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)規(guī)定梔子黃可用于果汁(味)型飲料、配制酒、糕點(diǎn)上彩妝、冰棍、雪糕、膨化食品、果凍、面餅、糖果和栗子罐頭等[4]。

梔子黃色素作為天然食用色素在中國廣泛使用，但其安全性問題尚存在爭議。研究表明，含較高濃度藏花素的梔子黃色素(含量92%)對(duì)大鼠的急性經(jīng)口LD50為3.16～4.64 g/kg[5]；含較低濃度藏花素的梔子黃色素(含量44.82%)對(duì)大鼠的急性經(jīng)口LD50>15 g/kg[6]。90天亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)表明，3 000 ppm的梔子黃色素粉劑使大鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴增大增多的趨勢(shì)[5]；可引起腎小管上皮色素沉著，主要作用靶器官為肝臟和腎臟，其NOAEL為0.5 g/kg[7-8]；1.5 g/kg及以上劑量染毒動(dòng)物出現(xiàn)體重減輕、胃腸道功能障礙、肝腎毒性等炎癥反應(yīng)和局部損傷[6]。

有關(guān)梔子黃色素的發(fā)育毒性的研究尚未見報(bào)道。本研究參考?xì)W洲替代方法驗(yàn)證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(DB-ALM Protocol n°113)、大鼠植入后全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)(DB-ALM Protocol n°123)和微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)(DB-ALM Protocol n°122)三種發(fā)育毒性的體外替代模型[9]，評(píng)價(jià)食用色素梔子黃潛在的體外胚胎發(fā)育毒性，以補(bǔ)充梔子黃色素的毒理學(xué)資料。

材料與方法

一、受試物

受試物梔子黃E500，藏花素含量46.11%。購自河南中大恒源生物科技股份有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF級(jí)SD大鼠(雄性280～300 g，雌性220～240 g)，購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，室溫20～25℃，濕度50%～60%，12 h明暗周期，自由飲水和攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后將雌、雄SD大鼠于18:00按2:1比例合籠，次日7:00進(jìn)行陰道涂片檢查，鏡下可見精子視為受孕，并記為受孕0 d。取受孕9.5 d的胚胎進(jìn)行全胚胎培養(yǎng)，取受孕13 d的胚胎進(jìn)行微團(tuán)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方案由北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理分會(huì)審查批準(zhǔn)。

小鼠胚胎干細(xì)胞系ES-D3[D3](ATCC?CRL-11632TM)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞BALB/3T3克隆A31細(xì)胞系(ATCC?CCL-163TM)及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系STO(ATCC?CRL-1503TM)均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

三、胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

1.細(xì)胞培養(yǎng)：STO細(xì)胞及BALB/3T3細(xì)胞在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。ES-D3細(xì)胞日常培養(yǎng)于Knockout DMEM完全培養(yǎng)基，需以STO細(xì)胞為飼養(yǎng)層進(jìn)行培養(yǎng)，以獲取其維持未分化狀態(tài)所需的細(xì)胞因子。以上細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱。

2. ES-D3及BALB/3T3細(xì)胞毒性測試：取與STO飼養(yǎng)層分離后的ES-D3細(xì)胞懸液或BALB/3T3細(xì)胞懸液，以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，染毒7 d后以MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性測試。梔子黃終濃度為0、7.8、15.6、31.3、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)平行重復(fù)3次。

3. ES-D3細(xì)胞分化測試：取與STO飼養(yǎng)層分離后的ES-D3細(xì)胞懸液，以每滴500個(gè)細(xì)胞、30 μl/滴的量點(diǎn)種于100 mm直徑培養(yǎng)皿蓋中，每蓋接種50-60滴，將皿蓋輕輕翻轉(zhuǎn)倒扣于培養(yǎng)皿上進(jìn)行懸滴培養(yǎng)。3 d后用染毒液將皿蓋上的擬胚體(embryoid bodies, EBs)轉(zhuǎn)移至60 mm直徑細(xì)菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。2 d后將染毒液以1 ml/孔的量加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將EBs轉(zhuǎn)移至孔板中央進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。5 d后于相差顯微鏡下觀察，有心肌搏動(dòng)者可認(rèn)為胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。對(duì)照組心肌搏動(dòng)率記為100%(對(duì)照組初始心肌搏動(dòng)率須大于87.5%)。

參照ECVAM關(guān)于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)模型的指南，以陽性物5-FU建立胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)模型。依據(jù)細(xì)胞毒性測試的結(jié)果將梔子黃終濃度設(shè)定為0、15.6、31.3、62.5、125.0、250.0 μg/mL。

4.發(fā)育毒性預(yù)測：根據(jù)560nm處吸光度值計(jì)算梔子黃抑制50%的ES-D3及BALB/3T3細(xì)胞增殖時(shí)的濃度IC50-D3及IC50-3T3。根據(jù)各組心肌搏動(dòng)率計(jì)算梔子黃抑制50%的ES-D3細(xì)胞分化的濃度ID50。胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷陌l(fā)育毒性預(yù)測模型包括三個(gè)判別方程(表1)。若方程I的值高于方程II和方程III，化學(xué)物判定為無發(fā)育毒性化學(xué)物；若方程II的值高于方程I和方程III，化學(xué)物判定為弱發(fā)育毒性化學(xué)物；若方程III的值高于方程I和方程II，化學(xué)物判定為強(qiáng)發(fā)育毒性化學(xué)物。

表1 胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷陌l(fā)育毒性預(yù)測模型Table 1 Prediction model of developmental toxicity in embryonic stem cell test

四、全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)

受孕9.5 d SD大鼠，乙醚麻醉后處死，無菌環(huán)境中于體視顯微鏡下分離胚胎。挑選含3～5個(gè)初始體節(jié)、外形飽滿的健康胚胎，隨機(jī)分組，每組至少7只，于37℃預(yù)溫、含相應(yīng)濃度受試物的即刻離心血清(100%大鼠血清、56℃滅活30 min、0.22 μm過濾、-20℃保存)中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。48 h后根據(jù)Brown′s評(píng)分法(表2)對(duì)胚胎進(jìn)行功能及形態(tài)學(xué)評(píng)分。

表2 Brown′s全胚胎培養(yǎng)形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Brown′s morphological scoring criteria in whole embryo culture test

根據(jù)ECVAM全胚胎培養(yǎng)模型的建議，若1 000 μg/mL受試物無明顯致畸效應(yīng)，全胚胎培養(yǎng)模型可認(rèn)定其為無發(fā)育毒性物質(zhì)。本研究中梔子黃色素濃度為0和1 000 μg/mL。

五、微團(tuán)培養(yǎng)模型

1.微團(tuán)培養(yǎng)：受孕13 d SD大鼠，乙醚麻醉后處死，取出子宮將胚胎從蛻膜團(tuán)中分離，挑選含40～45個(gè)體節(jié)的健康胚胎，取其肢芽制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔正中央點(diǎn)種5 μL，待細(xì)胞貼壁后每孔補(bǔ)足200 μL含相應(yīng)濃度受試物的Ham′s F-12培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d。

參照ECVAM關(guān)于微團(tuán)培養(yǎng)模型的指南，以陽性物5-FU建立微團(tuán)培養(yǎng)模型；梔子黃的終濃度為0.0、3.1、6.3、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1000.0 μg/mL。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，試驗(yàn)平行重復(fù)3次。

2. 微團(tuán)細(xì)胞增殖及分化檢測：經(jīng)中性紅染色后，活細(xì)胞將主動(dòng)攝取中性紅染料，并在酸性條件下呈粉色，其顯色程度與活細(xì)胞數(shù)呈正比。染毒結(jié)束后，以0.005%中性紅染色3 h后固定細(xì)胞30 min，以酸性乙醇提取60 min后于540 nm測定吸光度值以檢測其細(xì)胞增殖能力。經(jīng)阿利新藍(lán)染色后，軟骨細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白多糖將呈現(xiàn)藍(lán)色，其顯色程度與軟骨細(xì)胞數(shù)目呈正比。以 1%阿利新藍(lán)室溫染色過夜，6 mol/L鹽酸胍提取2 h后于620 nm測定吸光度值以檢測其細(xì)胞分化能力。

3. 發(fā)育毒性預(yù)測：根據(jù)中性紅染色測定的吸光度值，計(jì)算50%細(xì)胞增殖活性被抑制時(shí)的濃度(IC50)；根據(jù)阿利新藍(lán)染色的吸光度值計(jì)算50%細(xì)胞分化及集落形成受抑制的濃度(ID50)。微團(tuán)培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預(yù)測模型包括三個(gè)判別方程(表3)。若方程I的值高于方程II和方程III，化學(xué)物判定為無發(fā)育毒性化學(xué)物；若方程II的值高于方程I和方程III，化學(xué)物判定為弱發(fā)育毒性化學(xué)物；若方程III的值高于方程I和方程II，化學(xué)物判定為強(qiáng)發(fā)育毒性化學(xué)物。

表3 微團(tuán)培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預(yù)測模型Table 3 Prediction model of developmental toxicity in micromass test

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。當(dāng)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性時(shí)，采用單因素方差分析(one way ANOVA)并進(jìn)行Dunnett-t法兩兩比較。當(dāng)不滿足正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用Linear-by-Linear Association法進(jìn)行劑量相關(guān)趨勢(shì)性檢驗(yàn)。設(shè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各培養(yǎng)模型中的IC50及ID50使用GraphPad Prism 7 對(duì)數(shù)模型進(jìn)行擬合計(jì)算。

結(jié) 果

一、胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)評(píng)價(jià)梔子黃色素的體外發(fā)育毒性

1.胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證：將5-FU對(duì)ES-D3及BALB/3T3細(xì)胞毒性、對(duì)ES-D3細(xì)胞分化的結(jié)果，經(jīng)GraphPad Prism 7軟件擬合計(jì)算，其IC50-3T3為122.7 ng/mL，IC50-D3為84.3 ng/mL，ID50為26.6 ng/mL。代入胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷陌l(fā)育毒性預(yù)測判別公式得出：Function Ⅰ=-28.56，F(xiàn)unction Ⅱ=-14.33，F(xiàn)unction Ⅲ= 0.67，F(xiàn)unction Ⅲ的值>Function Ⅰ和Function Ⅱ，評(píng)價(jià)5-FU為強(qiáng)發(fā)育毒性物質(zhì)，符合該預(yù)測模型的建立標(biāo)準(zhǔn)，證明該模型建立成功。

2.胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)價(jià)梔子黃色素的發(fā)育毒性：如圖1D和1E所示，250 μg/mL以上濃度梔子黃可對(duì)BALB/3T3細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯影響，其IC50-3T3為236.57 μg/mL；62.5 μg/mL以上濃度的梔子黃可抑制ES-D3細(xì)胞的增殖，其IC50-D3為231.87 μg/mL。

如圖1F所示，62.5 μg/mL的梔子黃可明顯抑制ES-D3細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，經(jīng)GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線擬合，計(jì)算出梔子黃對(duì)ES-D3細(xì)胞分化的ID50為94.84 μg/mL，將擬合所得IC50-3T3、IC50-D3及ID50代入胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)預(yù)測模型的發(fā)育毒性預(yù)測判別公式得出：Function Ⅰ=3.87，F(xiàn)unction Ⅱ=6.26，F(xiàn)unction Ⅲ=-6.60，F(xiàn)unction Ⅱ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅲ，評(píng)價(jià)梔子黃為弱發(fā)育毒性物質(zhì)。

圖1 5-FU和梔子黃色素對(duì)BALB/3T3和ES-D3細(xì)胞的影響Figure 1 Effects of 5-FU and gardenia yellow pigment on BALB/3T3 and ES-D3(A)、(B)和(C)：5-FU對(duì)BALB/3T3和ES-D3細(xì)胞增殖的影響以及對(duì)ES-D3細(xì)胞分化的影響；(D)、(E)和(F)：梔子黃色素對(duì)BALB/3T3和ES-D3細(xì)胞增殖的影響以及對(duì)ES-D3細(xì)胞分化的影響。*P<0.05，**P<0.01。(A), (B) and (C):Effects of 5-FU on cell proliferation of BALB/3T3 and ES-D3 and cell differentiation of ES-D3, respectively; (D), (E) and (F):Effects ofgardenia yellow pigment on cell proliferation of BALB/3T3 and ES-D3 and cell differentiation of ES-D3, respectively. *P<0.05, **P<0.01。

二、全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)梔子黃色素的發(fā)育毒性

根據(jù)ECVAM的建議，在全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)中若1000 μg/mL受試物無明顯致畸效應(yīng)，全胚胎培養(yǎng)模型可認(rèn)定其為無發(fā)育毒性物質(zhì)。本研究中此劑量下梔子黃對(duì)胚胎卵黃囊直徑、頂臀長、頭長、體節(jié)數(shù)及形態(tài)學(xué)評(píng)分均無明顯影響，故可認(rèn)為梔子黃為無發(fā)育毒性物質(zhì)。

表4 梔子黃對(duì)胚胎各系統(tǒng)發(fā)育的影響Table 4 Effect of gardenia yellow pigment on

三、微團(tuán)培養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)梔子黃色素的發(fā)育毒性

1.大鼠微團(tuán)培養(yǎng)模型的建立與驗(yàn)證：將5-FU對(duì)微團(tuán)細(xì)胞增殖及分化影響的結(jié)果，經(jīng)GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線擬合計(jì)算，其IC50為109.10 ng/mL，ID50為90.85 ng/mL，代入微團(tuán)培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預(yù)測判別公式得出：Function Ⅰ=-16.01，F(xiàn)unction Ⅱ=-14.33，F(xiàn)unction Ⅲ=-0.14，F(xiàn)unction Ⅲ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅱ，評(píng)價(jià)5-FU為強(qiáng)發(fā)育毒性物質(zhì)，符合該預(yù)測模型的建立標(biāo)準(zhǔn)，證明該模型建立成功。

2.微團(tuán)培養(yǎng)模型評(píng)價(jià)梔子黃色素的發(fā)育毒性：如圖2B所示，100 μg/mL及以上濃度的梔子黃可顯著降低大鼠肢芽細(xì)胞增殖能力及分化為軟骨細(xì)胞的能力，其IC50為175 μg/mL。隨梔子黃濃度升高，微團(tuán)形成數(shù)目逐漸減少，軟骨細(xì)胞阿利新藍(lán)著色程度逐漸降低，單個(gè)微團(tuán)體積逐漸減小，細(xì)胞遷移距離逐漸縮短，至400 ng/mL組已無微團(tuán)形成(圖3)。

圖2 5-FU和梔子黃色素對(duì)肢芽細(xì)胞增殖活性和分化的影響Figure 2 Effects of 5-FU and gardenia yellow pigment oncell proliferation and differentiation of limb bud cells**：P<0.01；#：P<0.05，##：P<0.01。**:P<0.01; #:P<0.05, ##:P<0.01.

圖3 梔子黃對(duì)肢芽微團(tuán)形成的影響Figure 3 Effect of gardenia yellow pigment on limb bud micromass formation

經(jīng)GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線擬合計(jì)算，其ID50為152 μg/mL，代入微團(tuán)培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預(yù)測判別公式得出：Function Ⅰ= 5.02，F(xiàn)unction Ⅱ=5.15，F(xiàn)unction Ⅲ=-4.28，F(xiàn)unction Ⅱ的值大于Function Ⅰ和Function Ⅲ，評(píng)價(jià)梔子黃為弱發(fā)育毒性物質(zhì)。

討 論

梔子黃色素具有較好的著色性能，且研究表明具有抗疲勞、抗氧化、抗炎及降血糖作用等[10-13]。在我國和日本等周邊國家，梔子黃色素已作為食品添加劑廣泛使用。但梔子黃色素的食用安全性問題尚存在爭議。缺乏對(duì)其發(fā)育毒性的研究。本研究旨在通過體外發(fā)育毒性預(yù)測模型評(píng)價(jià)梔子黃色素的胚胎發(fā)育毒性，補(bǔ)充其毒理學(xué)資料，為確定梔子黃接觸的健康指導(dǎo)值、開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

全胚胎培養(yǎng)、微團(tuán)培養(yǎng)和胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑镋CVAM驗(yàn)證的發(fā)育毒性體外替代方法，具有耗時(shí)短、花費(fèi)少，靈敏度高等特點(diǎn)，更符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利倫理及“3R”原則，即減少(Reduction)、優(yōu)化(Refinement)、替代(Replacement)，可用于潛在胚胎發(fā)育毒性的篩選試驗(yàn)。胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)依據(jù)受試物對(duì)干細(xì)胞分化過程的影響判斷受試物在胚胎植入前階段的潛在發(fā)育毒性；全胚胎培養(yǎng)可以完整的模擬生物體植入后胚胎器官形成早期(孕9.5至11.5 d)對(duì)受試物的暴露過程；微團(tuán)培養(yǎng)從肢芽細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化能力的角度，判斷受試物是否具有中晚期(孕13天至18 d)發(fā)育毒性[14]。根據(jù)胚胎干細(xì)胞預(yù)測模型判斷梔子黃為弱發(fā)育毒性物質(zhì)。但ECVAM的指南中提示，若IC50和ID50的比值大于2，說明該物質(zhì)具有特異的潛在致畸性；若比值小于2，說明該物質(zhì)的發(fā)育毒性可能是由于細(xì)胞毒性引起的。在胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，梔子黃對(duì)ES-D3細(xì)胞的IC50為231.87 μg/mL，遠(yuǎn)高于ID50(94.84 μg/mL)，提示梔子黃色素可能具有潛在的特異性胚胎發(fā)育毒性，且梔子黃對(duì)植入前胚胎干細(xì)胞的毒性效應(yīng)更值得關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)，1 000 μg/mL梔子黃色素對(duì)大鼠植入后胚胎生長和發(fā)育無明顯影響，依據(jù)ECVAM指南建議，可判定其在胚胎器官形成期無發(fā)育毒性。

梔子黃色素可抑制肢芽細(xì)胞增殖活性，降低其分化為軟骨細(xì)胞的能力，對(duì)肢芽細(xì)胞的生長、遷移及再聚合具有一定影響。本研究發(fā)現(xiàn)，100 μg/mL梔子黃色素即可降低肢芽細(xì)胞的增殖能力及分化能力，對(duì)微團(tuán)形成數(shù)目及形態(tài)產(chǎn)生影響，依據(jù)ECVAM微團(tuán)培養(yǎng)預(yù)測模型判定其為弱發(fā)育毒性物質(zhì)。但其IC50和ID50值極為接近，表明梔子黃色素在大鼠胚胎發(fā)育中晚期的肢芽細(xì)胞分化阻滯效應(yīng)可能是由細(xì)胞毒性引起的。

梔子黃色素的主要活性成分為藏花素及藏花酸，但同時(shí)也含有綠原酸、多酚類物質(zhì)黃酮及環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)梔子苷等成分，此為導(dǎo)致梔子黃色素發(fā)生綠變的主要原因[15-16]。本研究中所用梔子黃色素為混合物，含藏花素46.11%、梔子苷0.03%。因此，梔子黃色素引起胚胎發(fā)育毒性的具體原因尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

綜上，可初步認(rèn)為梔子黃屬弱發(fā)育毒性物質(zhì)。但由于本研究采取的三種替代方法均為體外試驗(yàn)，不能分析母體代謝、母體-胎兒間相互作用等影響，且ECVAM對(duì)發(fā)育毒性體外替代方法的驗(yàn)證也認(rèn)為替代方法在強(qiáng)發(fā)育毒性化學(xué)物的判斷上準(zhǔn)確性較好，但不能準(zhǔn)確判別弱發(fā)育毒性化學(xué)物和無發(fā)育毒性化學(xué)物。因此，梔子黃色素的發(fā)育毒性還需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。