丹酚酸B-黃連素復(fù)合物對糖尿病小鼠腎損傷及SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路的影響*

胡媛媛 暴雪麗 武彥香 連 娟 祝嘉健 鄭春燕 胡雪紅 姜廣建△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

由于飲食和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年上升，預(yù)計(jì)到2045年全球糖尿病患者將達(dá)到6.93億[1]。此外，由糖尿病引起的一系列包括糖尿病性腎?。―N）等疾病在內(nèi)的各類臨床并發(fā)癥也嚴(yán)重威脅著糖患者的生命健康。

黃連素是黃連的主要有效成分，具有降糖、降脂、抗炎等多種藥理作用[2]。丹酚酸B主要是從丹參的根及其枝干中提取得到的活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等多種藥理活性[3]。研究表明，黃連素可抑制氧化應(yīng)激和醛糖還原酶，常用于DN的治療[4]；SalB可明顯減輕糖尿病大鼠腎纖維化，其機(jī)制與改善氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)[5]。前期研究表明，黃連素和丹酚酸B均具有改善糖尿病腎損傷的作用，但兩者的復(fù)配是否能通過調(diào)控沈默信息調(diào)節(jié)因子α相關(guān)酶1（SIRT1）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）信號(hào)通路從而協(xié)同改善糖尿病腎損傷的結(jié)果尚不清楚。本研究通過觀察黃連素、丹酚酸B及其復(fù)合物對糖尿病小鼠SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白的調(diào)控，探討其復(fù)合物對糖尿病腎損傷的效用機(jī)制，以及其是否能在糖尿病的治療中達(dá)到協(xié)同增效的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只8周齡雄性C57BL/6J小鼠購自北京斯貝弗生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)條件：溫度（23±2）℃，濕度（55±10）%，自由進(jìn)食進(jìn)水，12 h光暗交替循環(huán)。倫理批號(hào)：BUCM-4-2016061701-3001。高脂飼料、標(biāo)準(zhǔn)飼料（江蘇醫(yī)藥生物醫(yī)學(xué)有限公司）。

1.2 藥物 丹酚酸B、黃連素（純度98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）。所需濃度的懸浮液用超純水制備。

1.3 試劑與儀器 血清肌酐（Scr）、血清尿素（Urea）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PGC-1α、SIRT1（Proteintech公司）；伊紅染色液、蘇木素染色液（北京索萊寶生物科技有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；小鼠二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔二步法檢測試劑盒（北京中杉金橋公司）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京翱擎生物科技有限公司）；RM 2255輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（Leica Biosystems有限公司）。

1.4 模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對8周齡雄性C57BL/6J小鼠進(jìn)行45%高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)12周。12周后，禁食不禁水12 h，剪尾采血測定血糖值在10.0 mmol/L以上為建模成功[6]。

1.5 干預(yù)方法 將成模小鼠隨機(jī)分為模型組、丹酚酸B+黃連素組、黃連素組、丹酚酸B組，每組6只。丹酚酸B+黃連素組：丹酚酸B 100 mg/kg+黃連素50 mg/kg。丹酚酸B組：丹酚酸B 100 mg/kg。黃連素組：黃連素50 mg/kg。灌胃給藥，連續(xù)8周（每日1次）。給予正常組及模型組等體積生理鹽水。

1.6 觀察指標(biāo) 1）空腹血糖及生化指標(biāo)檢測：末次給藥后，禁食不禁水12 h，檢測空腹血糖（FBG）；摘眼球取血，試劑盒檢測血清Scr、Urea的水平。2）組織病理學(xué)檢查：將固定液中的腎臟組織脫水、透明、包埋、切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組腎臟組織的病理改變。3）免疫組織化學(xué)：將腎臟切片脫蠟至水，在檸檬酸鈉緩沖液中煮沸8 min，加入過氧化氫溶液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉1 h，滴加一抗[PGC-1α（1∶200）、SIRT1（1∶200）]，4 ℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。并采用Image-ProPlusv6.0軟件對圖像進(jìn)行分析。4）Western blotting法檢測SIRT1及PGC-1α的表達(dá)：測定小鼠腎臟組織的蛋白濃度。通過10%SDS-PAGE分離已變性的蛋白質(zhì)樣品，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h。添加一抗SIRT1（1∶800）、PGC-1α（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000），4 ℃過夜。取出條帶，TBST洗滌3次，室溫孵育對應(yīng)的二抗（1：5 000）1.5h。TBST洗滌3次，顯色，曝光。采用ImageJ對圖像進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠空腹血糖、血清肌酐及尿素水平的比較 見表1。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠FBG、Scr及Urea水平均明顯上升（P＜0.05）。與模型組相比，丹酚酸B+黃連素組小鼠FBG、Scr及Urea水平均顯著下降（P＜0.05）；黃連素組血清Urea水平明顯下降（P＜0.05）。已知血清肌酐和血清尿素是評(píng)估腎損傷的指標(biāo)。結(jié)果提示，丹酚酸B和黃連素的復(fù)合物有明顯的降糖作用，并能明顯減輕糖尿病小鼠的腎損傷。

表1 各組小鼠空腹血糖、血清肌酐及尿素水平比較（±s）

表1 各組小鼠空腹血糖、血清肌酐及尿素水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別n Scr（μmol/L）Urea（mmol/L）FBG（mmol/L）正常組模型組丹酚酸B+黃連素組黃連素組丹酚酸B組6 6 6 6 6 6.17±1.47 9.83±1.94*5.83±2.40△7.33±1.37 7.83±1.17 2.80±0.72 4.74±1.61*2.55±0.93△2.95±0.45△3.30±0.59 5.74±0.27 10.48±4.12*6.26±0.42△6.94±0.73 7.30±1.15

2.2 各組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)的比較 光鏡下：與正常組對比，模型組小鼠的腎臟組織進(jìn)行HE染色后臨床表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬變厚，系膜細(xì)胞增生。治療后，丹酚酸B+黃連素組、黃連素組和丹酚酸B組腎小球肥大及系膜增生的癥狀有明顯的減輕，其中丹酚酸B+黃連素組改善最為明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠腎臟病理改變光鏡圖（HE，400倍）

2.3 各組小鼠腎臟組織PGC-1α、SIRT1的表達(dá)情況比較 見表2。與正常組相比，模型組小鼠腎臟組織中PGC-1α及SIRT1的蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，丹酚酸B+黃連素組中PGC-1α及SIRT1的蛋白表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.05）；黃連素組中PGC-1α及SIRT1蛋白的表達(dá)較模型組均明顯上升（P＜0.05）；丹酚酸B組中SIRT1蛋白的表達(dá)較模型組顯著上升（P＜0.05）。結(jié)果提示，黃連素、丹酚酸B及其復(fù)合物可不同程度上使糖尿病小鼠腎臟中PGC-1α及SIRT1的表達(dá)增加，其中黃連素、丹酚酸B的復(fù)合物效果最為顯著。

表2 各組小鼠腎臟組織中PGC-1α、SIRT1蛋白的表達(dá)比較（±s）

表2 各組小鼠腎臟組織中PGC-1α、SIRT1蛋白的表達(dá)比較（±s）

組別正常組模型組丹酚酸B+黃連素組黃連素組丹酚酸B組n 6 6 6 6 6 PGC-1α 0.105±0.008 0.073±0.003*0.109±0.004△0.091±0.006△0.088±0.002*SIRT1 0.087±0.002 0.057±0.005*0.085±0.001△0.076±0.005*△0.074±0.003*△

2.4 各組小鼠腎臟組織中PGC-1α、SIRT1蛋白的表達(dá)比較 見表3，圖2。與正常組相比，模型組小鼠腎臟組織中PGC-1α及SIRT1的蛋白表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.05）。與模型組相比，丹酚酸B+黃連素組及黃連素組中PGC-1α及SIRT1的表達(dá)均明顯上升（P＜0.05）；丹酚酸B組中PGC-1α的表達(dá)較模型組均明顯上升（P＜0.05）。結(jié)果提示，黃連素、丹酚酸B及其復(fù)合物可不同程度上使糖尿病小鼠腎臟中PGC-1α及SIRT1的蛋白表達(dá)增加，其中黃連素、丹酚酸B的復(fù)合物效果最為顯著。

表3 各組小鼠腎臟組織中PGC-1α、SIRT1蛋白的表達(dá)比較（±s）

表3 各組小鼠腎臟組織中PGC-1α、SIRT1蛋白的表達(dá)比較（±s）

組別正常組模型組丹酚酸B+黃連素組黃連素組丹酚酸B組n 6 6 6 6 6 PGC-1α 1.05±0.05 0.37±0.01*1.20±0.03△0.90±0.21△0.83±0.19△SIRT1 0.62±0.16 0.26±0.05*0.68±0.08△0.61±0.06△0.47±0.09

圖2 各組小鼠腎臟組織中PGC-1α、SIRT1蛋白的表達(dá)

3 討 論

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為消渴的病機(jī)多是陰津虧損，燥熱偏盛（陰虛為本、燥熱為標(biāo)）?！皟?nèi)熱”為其主要病機(jī)之一，治療當(dāng)以清熱為主[7]。黃連苦、寒，善清中焦胃熱，符合消渴病胃熱熾盛（中消）的核心病理機(jī)制。消渴病日久，易耗傷津液，使血液運(yùn)行不暢而致血脈瘀阻。血瘀亦是消渴病的關(guān)鍵病理機(jī)制之一，且血瘀與消渴病多種并發(fā)癥的發(fā)生緊密相關(guān)。而丹參具有良好的活血祛瘀作用，祛瘀生新而不傷正，是臨床治療血瘀癥的首選之藥?，F(xiàn)代藥理研究顯示，黃連素為黃連的主要有效成分，具有多種生化和藥理作用，如降脂和抗糖尿病活性[8]。丹酚酸B是丹參提取物中的一種，對腎細(xì)胞具有抗炎、抗氧化作用[9]?；诖?，選擇以復(fù)合物的形式進(jìn)行干預(yù)，以起到協(xié)同增效的作用。

DN是與終末期糖尿病相關(guān)的最嚴(yán)重的繼發(fā)性并發(fā)癥之一，影響了將近1/3的終末期糖尿病患者[10]。高血糖所致的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致DN腎損傷的核心發(fā)病機(jī)制之一[11]。足細(xì)胞損傷是慢性腎臟疾病的重要病理機(jī)制之一，并最終可能導(dǎo)致DN的發(fā)展[12]。而氧化應(yīng)激被認(rèn)為可能是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的主要原因之一[13]。既往研究表明，黃連素可通過抑制氧化應(yīng)激來改善足細(xì)胞損傷[14]，并能抑制高脂飲食和STZ誘導(dǎo)的DN大鼠的腎損傷[8]。而大劑量的丹酚酸B則在足細(xì)胞內(nèi)具有抗氧化應(yīng)激的功效，這種功效可通過抑制ROS的生成來實(shí)現(xiàn)[15]。

SIRT1/PGC-1α是抗氧化損傷的重要內(nèi)源性通路之一，PGC-1α活性可被SIRT1激活并參與多種生物學(xué)途徑，如細(xì)胞凋亡、能量代謝、氧化應(yīng)激等[16]。PGC-1α主要存在于富含線粒體的組織中，其主要功能就是通過刺激線粒體進(jìn)行生物合成以調(diào)節(jié)能量代謝[17]。研究證明，PGC-1α是線粒體生物發(fā)生進(jìn)程中的一個(gè)關(guān)鍵介質(zhì)[18]。線粒體功能障礙將會(huì)產(chǎn)生過多的ROS，最終引起氧化應(yīng)激[19]。研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α介導(dǎo)的氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)，包括DN[20]，并能在DN模型中觀測到PGC-1α蛋白表達(dá)的下降[21]。因此，PGC-1α可能成為腎功能損傷的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，并且SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路可能在DN氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用。體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，可通過誘導(dǎo)PGC-1α促進(jìn)線粒體生物合成，保護(hù)線粒體功能，對抗氧化應(yīng)激的損傷[22]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，黃連素、丹酚酸B的復(fù)合物進(jìn)行干預(yù)治療后腎臟組織中SIRT1及PGC-1α的表達(dá)顯著上升，且效果明顯優(yōu)于丹酚酸B組和黃連素組，提示黃連素、丹酚酸B及其復(fù)合物在糖尿病小鼠中可能通過調(diào)節(jié)SIRT1/PGC-1α蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激的損傷，保護(hù)足細(xì)胞，改善腎臟的損害程度，防止病情進(jìn)一步向DN發(fā)展，并且黃連素、丹酚酸B復(fù)合物的效果更為顯著。

綜上所述，黃連素、丹酚酸B的復(fù)合物可顯著上調(diào)糖尿病小鼠腎臟組織中SIRT1/PGC-1α蛋白的表達(dá)，能明顯改善腎臟組織的病理損害，一定程度上可防治DN。