人胚胎干細胞外泌體中miRNAs的鑒定及其對缺氧心肌細胞作用機制的探討*

黃冰鑫 ， 陳 景 ， 吳文濤 ， 周建榮 ， 田 苗 ， 涂賈子超 ，劉 湘 ， 李曉紅 ， 陳寄梅 ，1△

［1華南理工大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510006；2廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院），廣東省心血管病研究所，廣東省華南結構性心臟病重點實驗室，廣東 廣州 510080］

心肌梗死占心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）發(fā)病和死亡的首位［1］。心肌梗死后由于缺血缺氧會導致心肌細胞死亡并伴有成纖維細胞增生形成瘢痕組織，導致心室重塑并最終發(fā)展至心力衰竭，給家庭和社會帶來嚴重的經濟負擔。目前臨床中主要的治療方式是藥物治療或重建冠狀動脈血運［2］，雖然能減少急性期死亡率，但是仍有相當大的改善機會和很多未解決的問題［3］。因此，深入了解心肌梗死的新的細胞和分子機制，尋找有效的治療新靶點，對于降低心肌梗死后死亡率、減輕患者和社會經濟負擔具有重要意義。

心肌梗死后心肌細胞的受損主要原因為缺氧缺血（hypoxia-ischemia，HI），在HI 情況下，心肌細胞會通過死亡受體通路、線粒體通路、內質網應激等途徑發(fā)生凋亡。如何有效減少心肌細胞凋亡，保護心肌免受HI 損傷是研究的重點。干細胞的心肌保護作用已被許多動物研究證實，其中干細胞分泌的外泌體被認為是起作用的主要成分［3］，與干細胞相比，外泌體在臨床應用中具有較多優(yōu)勢，在治療CVDs方面有廣闊前景。但目前關于人胚胎干細胞來源外泌體（human embryonic stem cell-derived exosomes，hESCEXO）對心肌細胞的作用仍不夠明確且研究相對較少，因此本研究選取hESC-EXO 為研究對象，探究其對缺氧人心肌細胞AC16的作用及可能機制。

材料和方法

1 材料

1.1 H9及AC16細胞培養(yǎng) 人胚胎干細胞系H9（購自中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心）接種于Growth Factor Reduced Matrigel 包被的 10 cm 皿 內進行擴增。采用PSCeasy 人多潛能干細胞完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，常規(guī)置于5% CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中，每24 h 換液，密度達70%以上時收集上清；人心肌細胞系AC16（購自武漢尚恩生物技術有限公司）采用含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液常規(guī)置于5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中，缺氧處理下不添加血清，置于94%N2、5%CO2、1%O2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 外泌體提取及鑒定 將H9 細胞培養(yǎng)上清液轉移到 50 mL 離心管中，4 ℃、3 000 r/min 離心 10 min，初步沉淀細胞碎片等雜質；取上清液，用30 mL 注射器通過Millex-GP 0.22μm 孔徑過濾膜將其過濾至新的 50 mL 離心管中，再分裝至 Amicon?Ultra-15 離心過濾器中，4 ℃、1 800×g離心40 min 濃縮上清液；取上清液分裝至超高速離心管中，4 ℃、100 000×g離心70 min，棄上清，加入PBS，4 ℃、100 000×g再次離心70 min，棄上清，PBS 洗滌沉淀1~2 次，100 μL PBS 溶解沉淀轉移至1.5 mL EP管中，-80 ℃保存。

外泌體樣本用1×PBS稀釋至約1 mL后用納米顆粒跟蹤分析儀（nanoparticle tracking analyzer，NTA）選取合適視野檢測外泌體粒徑，使用Zeta View 8.04.02 分析顆粒直徑及濃度；取5 μL 樣本于銅網上，經室溫孵育后加入2%乙酸雙氧鈾孵育1 min，干燥后透射電鏡觀察外泌體形態(tài)；使用RIPA 裂解液、PMSF 及蛋白酶抑制劑混合液提取外泌體蛋白，后續(xù)操作同2.4。

2.2 實驗分組 本實驗將AC16 細胞于常氧情況下擴增后，接種至6 孔板內，在缺氧條件下進行培養(yǎng)，分為缺氧條件加入外泌體組（HI+EXO組）及缺氧條件加入等體積PBS組（HI+PBS組），所用EXO 終濃度為3×109particles/L。

2.3 細胞凋亡檢測 （1）MTT 法檢測細胞活力：將AC16 細胞等密度接種到96 孔板，每孔體積200 μL（同時設置純培養(yǎng)基調零孔，加入MTT 和DMSO），每組設置4 個復孔，缺氧狀態(tài)下孵育20 h 后，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后每孔加入100 μL DMSO，搖床上震蕩10 min 使結晶物充分溶解，在570 nm 處測定吸光度。（2）流式細胞術檢測細胞凋亡：將缺氧處理后的AC16 細胞用冷PBS 洗滌2 次，用 1× Binding Buffer 重懸細胞濃度為 1×109/L，向 100 μL 溶液加入 5 μL PE-Annexin V 和 5 μL 7-AAD；輕輕震蕩細胞，在室溫、黑暗條件下孵育15 min；再向每個試管中加入400μL 1× Binding Buffer，設置單染及雙染以調整補償，1 h 內完成流式分析。（3）流式細胞術檢測線粒體膜電位：將試劑盒中提供的CCCP（10 mmol/L）按照1∶1 000 的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10 μmol/L，常氧下處理細胞20 min 作為陽性對照組。收集3組細胞上清，用PBS 洗滌，再用胰酶消化，加入相應上清后離心，用DMEM培養(yǎng)基重懸，加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。在孵育期間，配制適量的JC-1染色緩沖液置于冰浴中。37 ℃孵育結束后，棄上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次。加入2 mL細胞培養(yǎng)液，上流式細胞儀分析線粒體膜電位。

2.4 Western blot 檢測凋亡相關蛋白 提取HI+EXO 和HI+PBS組的蛋白，提取方法同外泌體蛋白提取，應用BCA 方法檢測蛋白含量，變性后每孔上樣15 μg，15% SDS-PAGE 分離，再轉印至 PVDF 膜上。采用含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液封閉45 min，洗滌3次后加入Ⅰ抗（1∶5 000稀釋），4 ℃搖床過夜。洗膜3 次加入后羊抗兔Ⅱ抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h，洗膜，加入適量ECL 發(fā)光液發(fā)光顯色，化學發(fā)光成像儀顯影。β-actin為內參照。

2.5 hESC-EXO 的全轉錄組測序 全轉錄組測序委托廣州華銀健康醫(yī)療集團股份有限公司進行，送去3例hESC-EXO 樣本進行測序，構建sRNA 文庫與去核糖體的鏈特異性文庫。sRNA 測序文庫可以獲得miRNA 序列信息，去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA 和 circRNA 的序列信息，并進行高通量測序。

2.6 定量PCR檢測miRNA表達情況 Trizol法提取兩組RNA 后，采用miRNA cDNA 第1 鏈合成試劑盒，按說明書配置反轉錄體系（加A 尾反應法）及設置反應條件得到cDNA，稀釋10 倍使用，得到cDNA 后配制PCR 反應液，采用20μL 體系，設定兩步法進行定量檢測，內參照使用U6，同時設置常氧組作為對照組，以計算相對表達。引物序列見表1。

表1 miRNA引物序列Table 1. Sequences of the primers for miRNA

2.7 miRNA 的生物信息分析 選取miRDB、TargetScanHuman 7.2 和ENCORI 3 個數(shù)據(jù)庫對差異量較高的miRNA 進行靶基因預測并取交集，對于基因集功能富集分析使用KEGG rest API（https：//www.kegg. jp/kegg/rest/keggapi. html）獲取最新的KEGG Pathway 的基因注釋，以此作為背景，將基因映射到背景集合中，使用R 軟件包clusterProfiler 3.14.3 進行富集分析，以獲得基因集富集的結果。設定最小基因集為5，最大基因集為5 000，F(xiàn)DR＜0.1。對于GO 分析則用 DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david. ncifcrf. gov/home. jsp）進行分析，通過String 數(shù)據(jù)庫構建蛋白相互作用網絡，以獲得對細胞機制和功能的全面描述。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 胚胎干細胞來源外泌體的提取及鑒定

NTA 結果顯示，檢測的外泌體直徑大約在83 nm左右（圖1A）；使用透射電鏡觀察H9 細胞來源外泌體可見清晰的囊泡結構，呈橢圓形，且大小符合外泌體的檢測標準（圖1B）；Western blot 法檢測外泌體特征性膜蛋白CD9 和CD63 呈陽性（圖1C）。以上特征表明分離得到的囊泡為外泌體。

2 hESC-EXO抑制缺氧AC16細胞凋亡

MTT 結果顯示，缺氧的AC16 細胞加入hESCEXO 后細胞活力較PBS組顯著增強，見圖2A；PEAnnexin V 的流式細胞術結果顯示，HI+EXO組相較于HI+PBS組凋亡細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），見圖2B；JC-1 探針流式細胞術結果顯示，HI+EXO組線粒體膜電位較HI+PBS組顯著升高（P＜0.05），見圖2C，表明ESC-EXO 可以減少AC16 缺氧情況下的早期凋亡；與PBS 對照相比，凋亡的標志性蛋白caspase-3在外泌體處理后降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 則在外泌體處理后表達增加，見圖2D。

3 hESC-EXO的全轉錄組測序

通過對hESC-EXO 進行全轉錄組測序，構建sRNA 文庫，獲得miRNA 序列信息，下機后進行測序數(shù)據(jù)過濾，對比到參考基因組，進行sRNA 分類注釋和miRNA 鑒定分析，最后進行miRNA 定量分析，選取表達豐度最高的miRNA 進行排序，表達含量較高的 miRNA 有 miR-16-5p、miR-93-5p、miR-148a-3p、miR-20b-5p、miR-302a-3p、miR-302d-3p、miR-19b-3p、miR-302b-3p、miR-182-5p、miR-101-3p；其中miR-302a/b/d-3p均屬于miR-302簇，為胚胎干細胞高水平表達的miRNA，見圖3。

4 ESC-EXO 處 理 后 AC16 細 胞 的 miRNA 表 達情況

分別在缺氧處理6 h 和24 h 后提取ESC-EXO 處理的AC16 細胞的總RNA，轉錄成cDNA 后進行定量PCR 分析，與PBS 對照組相比，測序所得含量較高的miRNA 在EXO 處理后的心肌細胞中都高表達，其中尤以miR-302a/b/d-3p表達顯著升高，見圖4。

Figure 1. hESC-EXO identification results. A：particle size and concentration of exosomes detected by NTA；B：transmission electron microscopic image of exosomes；C：exosome marker protein identification results.圖1 hESC-EXO鑒定結果

Figure 2. hESC-EXO inhibited apoptosis of hypoxic AC16 cells. A：cell viability was determined by MTT assay；B：cell apoptosis was detected by flow cytometry；C：mitochondrial membrane potential was determined by JC-1 probe and flow cytometry；D：caspase-3 and Bcl-2 expression was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs HI+PBS group.圖2 hESC-EXO抑制缺氧AC16細胞凋亡

Figure 3. Quantitative rank of miRNA results by hESC-EXO sequencing.圖3 hESC-EXO測序的miRNA結果定量排序

Figure 4. Expression of miRNA in AC16 cells after hypoxia treated with hESC-EXO. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs HI+BPS group.圖4 ESC-EXO處理缺氧后AC16細胞的miRNA表達情況

5 miR-302a/b/d-3p的生物信息學分析

通過3 個數(shù)據(jù)庫分別對miR-302a/b/d-3p 靶基因取交集后，再對miR-302a/b/d-3p靶基因取交集，得到519 個靶基因，通過GO/KEGG 富集分析及蛋白質相互作用網絡，發(fā)現(xiàn)miR-302a/b/d-3p 的靶基因主要參與 TGF-β、MAPK 和 PI3K-Akt 信號通路，核心作用的蛋白包括FOXO3、ESR1、RBBP7等，見圖5。

討 論

本實驗通過選取H9 細胞來源的EXO 作為研究對象，發(fā)現(xiàn)其可以促進缺氧情況下AC16細胞的存活，可以抑制線粒體膜電位降低，而線粒體膜電位的下降多出現(xiàn)在細胞凋亡早期。H9細胞來源的EXO處理后凋亡時表達升高的標志性蛋白caspase-3 表達下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，流式細胞術檢測顯示H9細胞來源的EXO 減少缺氧后的AC16 細胞凋亡。在對H9 細胞來源的EXO 進行測序后發(fā)現(xiàn)miR-302a/b/d-3p在外泌體中含量較高，且處理AC16細胞后，細胞內miR-302a/b/d-3p 含量也明顯增加，其機制可能是參與調控多條凋亡相關的通路而發(fā)揮心肌保護作用。

近年來，基于干細胞的療法已成為CVDs中有應用前景的治療策略，其中干細胞來源的外泌體由于其更安全有效等特性有望成為新的治療工具［5］。外泌體是細胞內吞途徑循環(huán)的最終產物，通過胞吐釋放至細胞外［6］，富含多種生物活性物質，包括蛋白質、RNA（mRNA、miRNA 和lncRNA）、DNA（mtDNA、ssDNA 和dsDNA）、脂質等［6］，在細胞間可以發(fā)揮多種生物學作用。目前已有較多動物實驗證實干細胞源性外泌體可以通過調節(jié)細胞凋亡、炎癥、纖維化、血管生成等治療心梗、心肌缺血再灌注損傷、肺高壓等心血管疾?。?-9］，但研究多集中在間充質干細胞來源的外泌體以及多以動物源性外泌體進行實驗［10］，關于胚胎干細胞來源的外泌體則研究較少。本研究主要通過選取人胚胎干細胞系H9 進行研究，作用在人心肌細胞系AC16上，觀察了其對于缺氧心肌細胞的保護作用。

因為miRNA 存在廣泛多樣的生物學功能，以及其在外泌體中的高豐度存在和相對不易降解，所以外泌體研究中又多以miRNA 研究為主。目前有研究確定了外泌體含有的多種miRNA 可以緩解心梗［11-12］、抑制心肌細胞肥大、抗心肌纖維化、促進血管新生等［13］。但對于胚胎干細胞源外泌體中高豐度表達的miR-302/367 簇則少有研究提及。本研究所發(fā)現(xiàn)的miR-302a/b/d-3p 均屬于miR-302 簇，不僅在hESC-EXO 中含量較多，且經hESC-EXO 處理后AC16 細胞內miR-302a/b/d-3p 含量也明顯增加。多數(shù)研究表明miR-302/367 簇參與多種重要的生物學過程包括細胞增殖、分化、重編程、腫瘤發(fā)生、器官發(fā)育、自身免疫以及ESC 和誘導多能干細胞的多能性維持等［13］。目前miR-302 在心血管領域中的研究并不多見，已發(fā)表的研究主要和Hippo信號通路作用有關［16］，其具體的作用機制仍存在爭議［17-19］。在對miR-302a/b/d-3p 進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)其可能作用的核心蛋白FOXO3 是調節(jié)自噬的主要轉錄因子，與凋亡有著密切的聯(lián)系［20］。此外可能作用的MAPK、PI3K-Akt等信號通路也有研究表明可以調節(jié)細胞自噬［21］，因此hESC-EXO所含的miR-302a/b/d-3p可能主要通過調節(jié)自噬減少凋亡來完成對心肌細胞的保護作用。

Figure 5. Bioinformatics analysis results of miR-302a/b/d-3p. A：intersection of miR-302a/b/d-3p target genes in different databases；B：intersection of miR-302a/b/d-3p target genes；C：GO enrichment analysis of miR-302a/b/d-3p；D：KEGG pathway analysis of miR-302a/b/d-3p；E：protein interaction network diagram of miR-302a/b/d-3p target gene，where light blue and pink represent known interactions from professional databases and experimentally determined results，respectively；Green，red，and dark blue represent predicted interactions from gene adjacency，fusion，and co-expression，respectively.圖5 miR-302a/b/d-3p生信分析結果

綜上所述，hESC-EXO 可以減少心肌細胞的凋亡，其特殊性高表達的miR-302簇尤其是miR-302a/b/d-3p可通過外泌體作用到心肌細胞并產生保護作用，但具體的作用機制及靶點仍需要進一步的實驗驗證。