星形膠質(zhì)細(xì)胞在凝膠環(huán)境下的三維培養(yǎng)

李摯雯，劉志成，錢秀清

1.首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京100069；2.臨床生物力學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069

前言

青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、視乳頭萎縮及凹陷、進(jìn)行性視野缺損為共同特征的神經(jīng)退行性疾?。?］。病理性眼壓（Intraocular Pressure,IOP）升高是青光眼發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素［2］。目前普遍認(rèn)為青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生損傷進(jìn)而凋亡的起始部位在視乳頭篩板處［3-4］。星形膠質(zhì)細(xì)胞是視乳頭部位最常見的細(xì)胞類型，對(duì)視乳頭具有支持及營(yíng)養(yǎng)的功能。研究發(fā)現(xiàn)視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞在青光眼視神經(jīng)損害的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［5］。眼壓升高時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化往往發(fā)生在視神經(jīng)軸突損傷之前［6］。因此，研究壓力作用下視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)具有重要意義。然而，傳統(tǒng)二維環(huán)境下的體外培養(yǎng)不能為細(xì)胞提供足夠的生化和生理刺激［7］，主要原因在于二維基質(zhì)機(jī)械性能的差異以及細(xì)胞缺乏與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用［8］。有研究證明三維培養(yǎng)能提高細(xì)胞體外培養(yǎng)的生理相關(guān)性［9-10］。本研究嘗試建立一個(gè)與視乳頭力學(xué)特性相似的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞的在體生長(zhǎng)環(huán)境；同時(shí)，該三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有足夠的剛度，便于不同壓力的加載。

水凝膠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，近年來人們對(duì)使用水凝膠構(gòu)建體外三維凝膠環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞、研究細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)產(chǎn)生了濃厚的興趣［11-12］。以往的研究在利用瓊脂糖凝膠對(duì)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的力學(xué)加載中發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖的剛度隨凝膠濃度增加，并影響力學(xué)作用下細(xì)胞的位移和變形［13-14］；同時(shí)，軟骨細(xì)胞在瓊脂糖凝膠中受到機(jī)械刺激后會(huì)發(fā)生蛋白表達(dá)的變化［15］。以往對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞凝膠環(huán)境的構(gòu)建多基于膠原蛋白凝膠［16-17］以及膠原蛋白和透明質(zhì)酸制成的光交聯(lián)水凝膠［18］。結(jié)合之前的文獻(xiàn)，測(cè)得的膠原蛋白凝膠的彈性模量?jī)H為20～200 Pa［19］，不能用作星形膠質(zhì)細(xì)胞承受壓力載荷的介質(zhì)。因此，本研究嘗試運(yùn)用不同濃度的瓊脂糖凝膠系統(tǒng)模擬細(xì)胞的三維微環(huán)境，從而為下一步探究壓力作用下星形膠質(zhì)細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

SD大鼠（出生2～3周）視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞（普諾賽，中國(guó)武漢）；DMEM/F-12（1：1）培養(yǎng)基（Hyclone,美國(guó)）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS；Gibco,美國(guó)）；青霉素和鏈霉素（Penicillin-streptomycin；Hyclone,美國(guó)）；含有EDTA的胰酶（Trypsin 0.25%）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,PBS；Hyclone,美國(guó)）；低熔點(diǎn)瓊脂糖（索萊寶,中國(guó)北京）；Tris硼酸緩沖液（TBE,普利萊,中國(guó)北京）；水溫計(jì)；生物納米壓痕儀Piuma Nanoindenter（Opitics 11,荷蘭）；STED超高分辨率共聚焦顯微鏡（TCS SP8 STED,Leica,德國(guó)）；Calcein AM/PI雙染試劑盒（百奧萊博,中國(guó)北京）；Hank's平衡鹽溶液（Hank's Balanced Salt Solution,HBSS；索萊寶,中國(guó)北京）；抗熒光衰減封片劑（索萊寶,中國(guó)北京）；4%多聚甲醛（碧云天,中國(guó)上海）；鬼筆環(huán)肽（Phalloidin-iFluor 488 Reagent,Abcam,美國(guó)）。

1.2 凝膠的準(zhǔn)備與力學(xué)特性的測(cè)試

使用不同濃度的瓊脂糖凝膠模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。將低熔點(diǎn)瓊脂糖粉末與TBE 溶液混合，高溫煮沸后得到凝膠質(zhì)量濃度分別為1%、2%、3%（w/v）的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。

利用納米壓痕儀Piuma Nanoindenter（Opitics 11,荷蘭）測(cè)得凝膠的力學(xué)特性。將不同濃度的凝膠置于半徑為20 mm 的培養(yǎng)皿中，選擇懸臂彈簧常數(shù)為0.44 N/m、半徑為101 μm 的球形探針進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn)。首先探針從原點(diǎn)以10 μm/s 的速度進(jìn)行加載，直至壓入深度約為10 μm 時(shí)停止，獲得壓痕曲線的加載段；在壓入深度約10 μm 處?kù)o置1 s，再以10 μm/s 的速度進(jìn)行卸載，回到原點(diǎn)，獲得壓痕曲線的卸載段。獲得載荷-位移曲線后，使用赫茲模型擬合曲線獲得彈性模量［20-21］。凝膠每組3 個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試（n=9），取平均值作為測(cè)試結(jié)果。

1.3 細(xì)胞在凝膠中的培養(yǎng)

對(duì)購(gòu)買的SD 大鼠（出生2～3周）視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞（普諾賽，中國(guó)武漢），通過特異性標(biāo)志蛋白的免疫熒光化學(xué)染色的方式進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞被胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，重懸，并在37 ℃下與凝膠混合均勻，控制細(xì)胞密度在1×106個(gè)/mL。將凝膠轉(zhuǎn)移至直徑為15 mm 的共聚焦皿中，并加入1 mL 的DMEM/F12（10% FBS，1%雙抗），置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 天換液，分別于體外培養(yǎng)的第1、3、5 和7 天進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)和細(xì)胞骨架觀察。

1.4 細(xì)胞活性的檢測(cè)

為評(píng)估三維凝膠系統(tǒng)體外細(xì)胞培養(yǎng)的可行性，使用標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)估星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。利用Calcein AM/PI 雙染試劑盒中染料稀釋劑將Calcein AM 染色液和PI染色液稀釋10倍，之后用HBSS溶液將Calcein AM 染色液和PI 染色液分別稀釋至1 000倍和2 000 倍。凝膠在共聚焦皿中用PBS 清洗2～3次，加入150 μL 稀釋1 000 倍的Calcein AM 染色液，37 ℃避光孵育30 min。用PBS 洗滌細(xì)胞后，加入150 μL稀釋2 000倍的PI染色液，37 ℃避光孵育25 min，用PBS洗滌后，滴加抗熒光淬滅劑封片。

用STED 超高分辨率共聚焦顯微鏡（TCS SP8 STED,Leica,德國(guó)）選用20倍干鏡對(duì)凝膠染色情況進(jìn)行觀察，拍照。使用488 nm 波長(zhǎng)激發(fā)，活細(xì)胞為黃綠色；用545 nm 波長(zhǎng)激發(fā)，死細(xì)胞為紅色。從每個(gè)水凝膠的3 個(gè)位置獲取共聚焦圖像，掃描深度100 μm，掃描間隔為5 μm，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行疊加；最后用Image J對(duì)得到的圖像進(jìn)行閾值處理，對(duì)存活和死亡細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行量化，從而得到細(xì)胞活性。

1.5 細(xì)胞骨架的觀察

用PBS清洗凝膠3次，加入4%的多聚甲醛200 μL在室溫固定30 min。吸出固定液，用PBS清洗固定的細(xì)胞3次。加入0.1%的Triton X-100（PBS配置）室溫通透5 min，用PBS 清洗細(xì)胞3 次。每個(gè)孔中加入150 μL 鬼筆環(huán)肽染色液，在室溫下孵育細(xì)胞90 min。用PBS 輕輕地沖洗細(xì)胞3 次，滴加抗熒光淬滅劑封片。使用STED 超高分辨率共聚焦顯微鏡在皿中任意選取3 個(gè)位置，選用40 倍油鏡對(duì)凝膠染色情況進(jìn)行觀察，拍照。熒光激發(fā)波長(zhǎng)為493 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為517 nm。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。各組組間差異性采用單因素方差分析進(jìn)行比較；通過Bonferroni 事后檢驗(yàn)確定顯著性差異，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝膠力學(xué)特性測(cè)試結(jié)果

使用Origin（OriginPro 2021, Originlab）軟件擬合載荷-位移加載曲線，黑色數(shù)據(jù)點(diǎn)組成的曲線為壓入載荷-壓入深度加載段原始曲線，紅色曲線為通過Hertz 公式計(jì)算的擬合曲線（圖1a～c），曲線的平均擬合優(yōu)度R2為0.996±0.002。結(jié)果顯示，1%、2%、3%瓊脂糖凝膠的楊氏模量分別為（2.99±0.59）、（25.42±3.89）、（64.03±9.94）kPa（圖1d）。3 種凝膠濃度中任意兩組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（**P<0.01）。隨著瓊脂糖濃度的增加，凝膠彈性模量逐漸增加，2%的瓊脂糖凝膠的彈性模量最接近篩板組織的彈性模量［22-24］。

圖1 瓊脂糖凝膠力學(xué)特性Figure 1 Mechanical properties of agarose gels

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定結(jié)果

對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白的免疫熒光化學(xué)染色見圖2，綠色熒光為星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白，藍(lán)色熒光為DAPI 所染細(xì)胞核。陽性細(xì)胞數(shù)占90%以上，即細(xì)胞純度達(dá)90%以上，所購(gòu)細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞。

圖2 星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光圖像Figure 2 Immunofluorescence image of astrocytes

2.3 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

分別對(duì)在不同濃度的凝膠中培養(yǎng)1、3、5、7 d 的細(xì)胞成活率進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在2%和3%瓊脂糖凝膠中成活率分別在第1 天和第3 天達(dá)到最高（圖3a、b）。其中生長(zhǎng)在2%瓊脂糖凝膠中細(xì)胞的成活率隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少。生長(zhǎng)在1%瓊脂糖凝膠中的細(xì)胞，在1、3、5 d細(xì)胞成活率均低于2%、3%凝膠環(huán)境下生長(zhǎng)的細(xì)胞。培養(yǎng)1 d，2%凝膠成活率較1%的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05）。培養(yǎng)3 d，2%凝膠成活率較3%的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05），1%凝膠成活率較3%的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.01）。培養(yǎng)5、7 d，不同凝膠濃度間，細(xì)胞成活率均沒有顯著性差異，可以推測(cè)在一定時(shí)間之后細(xì)胞在不同凝膠中生長(zhǎng)無顯著性差異。綜上所述，這幾種濃度的凝膠均能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活，其中細(xì)胞在2%、3%濃度的瓊脂糖凝膠中細(xì)胞成活率較1%濃度的瓊脂糖凝膠更好。

圖3 不同濃度凝膠細(xì)胞成活率的變化Figure 3 Changes in the viability of cells cultured in different concentrations of gels

2.4 細(xì)胞骨架

通過對(duì)在不同瓊脂糖濃度下培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞骨架觀察發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞在凝膠中培養(yǎng)的時(shí)間增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起逐漸伸出，細(xì)胞從大多數(shù)的球形向梭形或星形轉(zhuǎn)變（圖4），在不同的濃度的凝膠環(huán)境下均有變化，說明細(xì)胞在凝膠中可以正常生長(zhǎng)，并且更接近正常的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖5）。

圖4 典型細(xì)胞骨架變化Figure 4 Typical cytoskeleton changes

圖5 不同濃度凝膠中細(xì)胞骨架的變化Figure 5 Changes of cytoskeleton in different concentrations of gels

3 討論

高眼壓作用會(huì)導(dǎo)致視乳頭區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化［6］，而星形膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境由彈性模量為10～17 kPa 的篩板和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突構(gòu)成［22］。了解星形膠質(zhì)細(xì)胞的力學(xué)環(huán)境對(duì)理解星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有重要的意義。為研究壓力作用下視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)，需要建立一個(gè)與視乳頭力學(xué)特性相似的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。有研究使用I型膠原蛋白凝膠［16-17］以及膠原蛋白和透明質(zhì)酸制成的光交聯(lián)水凝膠［18］進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，然而膠原蛋白凝膠的彈性模量?jī)H為20～200 Pa［19］，不能用于研究壓力作用下星形膠質(zhì)細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)。瓊脂糖凝膠的彈性模量范圍大（1～200 kPa）［25］，通過調(diào)節(jié)瓊脂糖凝膠的濃度可模擬最接近星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的三維凝膠環(huán)境。

本研究通過對(duì)不同濃度凝膠力學(xué)特性進(jìn)行測(cè)試，以期尋找到最接近星形膠質(zhì)細(xì)胞在體生長(zhǎng)的凝膠環(huán)境；并通過對(duì)細(xì)胞活性以及形態(tài)評(píng)估星形膠質(zhì)細(xì)胞在凝膠中生存的可行性。研究發(fā)現(xiàn)2%瓊脂糖凝膠力學(xué)特性最接近星形膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境，且細(xì)胞成活率較高，是星形膠質(zhì)細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的理想環(huán)境。然而，2%和3%瓊脂糖凝膠中的細(xì)胞成活率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化存在波動(dòng)，可能的原因在于本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取的測(cè)量位置存在誤差。之后的實(shí)驗(yàn)會(huì)增加測(cè)量位置及測(cè)量次數(shù)，從而探究凝膠不同位置細(xì)胞成活率的一致性和準(zhǔn)確性。同時(shí)，細(xì)胞接種密度可能會(huì)導(dǎo)致凝膠彈性模量的改變，將進(jìn)一步探究不同細(xì)胞接種密度與凝膠彈性模量的影響。

本研究建立了星形膠質(zhì)細(xì)胞體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)，未來將基于此系統(tǒng)，在體外環(huán)境下模擬星形膠質(zhì)細(xì)胞的在體生長(zhǎng)環(huán)境探究星形膠質(zhì)細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)響應(yīng)［26］，從而研究青光眼發(fā)病過程中的力學(xué)敏感蛋白和力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)通路，為青光眼早期診斷尋找新思路。