菌株對(duì)苜蓿和燕麥中木質(zhì)素降解的影響

裴麗鵬，熊 乙，聶志文，宋佳磊，劉寧寧，許慶方

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.朔州市久強(qiáng)富朔農(nóng)業(yè)科技有限公司，山西 朔州 036002；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801）

在國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于促進(jìn)畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的意見（國(guó)辦發(fā)〔2020〕31號(hào)）中，再次重申了苜蓿（Medicago sativaL.）和燕麥干草（Avena sativaL.）作為主栽飼草的地位。然而苜蓿和燕麥的木質(zhì)素含量隨著生育期的推進(jìn)而逐步提高[1-2]，木質(zhì)素的提高降低了苜蓿和燕麥的飼用價(jià)值[3-4]。木質(zhì)素可以通過物理、化學(xué)與生物學(xué)等方法降解，而生物降解是高效安全的方法之一[5-7]。顧曉利等[8]利用微生物使木質(zhì)素得到有效的降解。此方法具有降解率高、安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。近年來，大量研究表明，木質(zhì)素是苯丙烷類聚合物難被降解，主要是通過菌株分泌漆酶、過氧化物酶和錳過氧化物酶，以達(dá)到催化木質(zhì)素的解聚[9-11]。韓東晶等[12]以木質(zhì)素為底物，初步探究R.ornithinolyticaRS-1細(xì)菌在木質(zhì)素降解中的效果。

本試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行取樣、定向篩選、功能評(píng)價(jià)和產(chǎn)物分析，獲得了阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai，BA）、約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii，AJ）、魯菲不動(dòng)桿菌（Acinetobacter lwoffii，AL）、云南微球菌（Micrococcus yunnanensis，MY）、類動(dòng)膠杜搟氏菌（Duganella zoogloeoides，DZ）和鞘氨醇桿菌（Sphingobium yanoikuyae，SY）6株可以高效降解木質(zhì)素的細(xì)菌菌株[13]。2020年10月至2021年9月筆者通過在苜蓿和燕麥干草添加6株菌株，觀察其降解木質(zhì)素的效果，進(jìn)一步分析這6株菌株對(duì)提升干草的飼用品質(zhì)影響，旨在為高質(zhì)量苜蓿燕麥干草的生產(chǎn)提供高效的菌劑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)干草 試驗(yàn)干草分別為苜蓿干草和燕麥干草，苜蓿品種為金皇后紫花苜蓿，燕麥品種為燕科2號(hào)，種子購自北京正道農(nóng)業(yè)股份有限公司，種植于山西省晉中市太谷區(qū)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。分別將處于初花期和灌漿期的苜蓿和燕麥刈割晾曬后帶回實(shí)驗(yàn)室，利用壓捆機(jī)壓成草捆，裝入直徑12 cm、高10 cm圓柱體收納盒中備用。

1.1.2 試驗(yàn)菌劑 將山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存的6株菌株取出并活化，菌株分別為阿氏芽孢桿菌（厚壁菌門，芽孢桿菌屬）、約氏不動(dòng)桿菌（變形菌門，不動(dòng)桿菌屬）、魯菲不動(dòng)桿菌（變形菌門，不動(dòng)桿菌屬）、云南微球菌（放線菌門，微球細(xì)菌屬）、類動(dòng)膠杜搟氏菌（變形菌門，杜搟氏菌屬）、鞘氨醇桿菌（變形菌門，鞘脂菌屬）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將6株菌株經(jīng)過活化處理后，配制成新鮮細(xì)菌懸液，作為接種劑備用。在500 mL干草捆收納盒中放置密度約為320 kg/m3的干草捆，苜蓿和燕麥干草捆質(zhì)量大約為160 g，以不添加任何菌劑的苜蓿和燕麥干草為對(duì)照組，其他6個(gè)處理組的苜蓿和燕麥干草分別均勻加入6種木質(zhì)素降解菌的接種菌，加入量以30 mL為宜，每毫升菌數(shù)應(yīng)保持≥1×106cfu，在室溫中貯藏30 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

苜蓿和燕麥干草經(jīng)過30 d貯藏后，對(duì)其養(yǎng)分品質(zhì)采用近紅外光譜分析技術(shù)法（NIRS）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目包括干物質(zhì)（DM）、粗灰分（Ash）、粗脂肪（EE）、粗蛋白（CP）、木質(zhì)素（Lignin）以及酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF），在評(píng)估飼用價(jià)值時(shí)引入豐富的指標(biāo)，包括總可消化養(yǎng)分（TDN）、相對(duì)飼喂價(jià)值（RFV）、相對(duì)牧草品質(zhì)（RFQ）及奶噸指數(shù)（Milkpton）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均錄入到Office Excel 2010系統(tǒng)中，完成對(duì)數(shù)據(jù)的初步整理與分析，采用SPSS 24.0進(jìn)行單因素分析干草的養(yǎng)分品質(zhì)，多重分析采用Duncan法，檢驗(yàn)結(jié)果評(píng)估以0.05為衡量界限，＜0.05表示組間差異大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用Origin 2022進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑處理苜蓿干草的營(yíng)養(yǎng)成分變化

經(jīng)6種菌劑處理后，苜蓿干草的營(yíng)養(yǎng)成分均發(fā)生顯著的提高（圖1）。接種6種菌劑后處理組DM的含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），DM含量顯著的提高并未造成苜蓿成分的揮發(fā)；Ash含量在菌劑處理后SY組和MY組的含量最高，BA組和DZ組間含量無顯著差異（P＞0.05），AL組和AJ組間無顯著差異；EE含量最高的是CK和AL組，均顯著高于其他組（P＜0.05）；CP的含量在AL組和AJ組最高。與對(duì)照組相比，CP、Ash含量的提高可能是由于微生物在處理干草的過程中對(duì)木質(zhì)素以及其他抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解。CP高的飼草代表該飼草可以產(chǎn)生較高的TDN值，是優(yōu)質(zhì)飼草指標(biāo)之一。

由圖2可知，經(jīng)6種菌劑處理后，苜蓿干草的木質(zhì)素含量均顯著降低。AL組和AJ組的木質(zhì)素含量最低，顯著低于其他組（P＜0.05），可能是這2株細(xì)菌可以有效降解芳香類化合物。在AL組中ADF和NDF的含量顯著低于其他組（P＜0.05）。MY組的ADF和NDF含量最高，與CK無顯著差異（P＞0.05）。其他組的ADF和NDF含量也有了顯著的下降。木質(zhì)素的有效降低會(huì)提高反芻動(dòng)物對(duì)飼草的消化吸收率，降低對(duì)資源的浪費(fèi)。

2.2 菌劑處理燕麥干草的營(yíng)養(yǎng)成分變化

由圖3可知，經(jīng)菌劑處理后燕麥干草的營(yíng)養(yǎng)成分和對(duì)照相比，除BA組外，其他組均未造成干物質(zhì)的損失；Ash含量最高組為AJ組和SY組，未造成燕麥干草礦物質(zhì)含量的損失；SY組的EE含量最高，細(xì)菌在發(fā)酵過程中會(huì)有脂肪酶的產(chǎn)生；CP含量最高的是DZ組和CK，但也無顯著差異（P＞0.05）。

由圖4可知，經(jīng)菌劑處理后的燕麥干草中，木質(zhì)素含量均未得到有效降解。AJ、DZ、SY、MY處理的NDF含量均未得到有效降解，NDF較高的含量會(huì)降低燕麥的飼草品質(zhì)。木質(zhì)素含量最低的處理為SY和AJ，說明這2株菌對(duì)芳香烴和烷烴均表現(xiàn)出降解力，使其可以有效降解木質(zhì)素；BA、AJ和MY的ADF含量均顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。

2.3 菌劑處理苜蓿干草的飼用價(jià)值

添加菌劑后苜蓿干草的飼用價(jià)值變化如圖5所示。

從圖5可以看出，添加菌劑后評(píng)估苜蓿干草的飼用價(jià)值，AL組的TDN、RFV、RFQ和Milkpton等4項(xiàng)指標(biāo)均為最高；僅MY組的TDN和Milkpton指標(biāo)比對(duì)照低，其余添加菌劑處理組的各項(xiàng)指標(biāo)均高于對(duì)照。飼用價(jià)值評(píng)價(jià)是評(píng)定飼草品質(zhì)的一種方式，TDN越高代表該飼草的消化率和動(dòng)物消化能力越高。菌劑處理后苜蓿干草中ADF和NDF的降低是有效反映RFQ升高的指數(shù)之一。

2.4 菌劑處理燕麥干草的飼用價(jià)值

從圖6可以看出，菌劑處理燕麥干草的飼用價(jià)值，與CK相比，TDN和Milkpton的含量均有所降低，未優(yōu)化燕麥干草的飼用價(jià)值；經(jīng)BA菌劑處理后的燕麥干草的RFQ含量提高，但其他菌劑與CK相比，均有所降低。

3 討論

3.1 6種菌劑對(duì)木質(zhì)素的處理效應(yīng)不同

本研究表明，除云南微球菌外，添加其他5種菌劑均使2種干草的木質(zhì)素有了不同程度的降解，其中，魯菲不動(dòng)桿菌效果顯著。

約氏不動(dòng)桿菌和魯菲不動(dòng)桿菌是不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌。木質(zhì)素由多種芳香化合物組成。許多研究表明，不動(dòng)桿菌能夠降解芳香烴和酚類物質(zhì)。劉玉華等[14]研究表明，從油井溢油所污染的土壤中分離出約氏不動(dòng)桿菌BA-15，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌可以降解芳香類化合物，在pH為6.0~7.0、30℃下表現(xiàn)出極佳的降解力，對(duì)廢油的降解率超過64%。渤海灣廢油區(qū)提取出不動(dòng)桿菌Tust-DM21，其對(duì)廢油的降解力表現(xiàn)在對(duì)于烷烴和芳香烴的有效降解，降解率高于80%[15-16]。以上研究表明，魯菲不動(dòng)桿菌在石油中對(duì)芳香化合物表現(xiàn)出降解的特性，其能夠降解木質(zhì)素，是因?yàn)樗鼈兊牡孜锞哂蓄愃频膯苇h(huán)芳香結(jié)構(gòu)，使其具有降解木質(zhì)素的能力。在本試驗(yàn)中，魯菲不動(dòng)桿菌對(duì)木質(zhì)素表現(xiàn)出較高的降解率。

阿氏芽孢桿菌是芽孢桿菌屬細(xì)菌。在紡織業(yè)中,研究發(fā)現(xiàn)，阿氏芽孢桿菌DC100可以產(chǎn)生降解木質(zhì)素的酶：漆酶和過氧化物酶，并對(duì)其進(jìn)行了降解木質(zhì)素的研究[17-18]。PAZ等[19-20]研究表明，阿氏芽孢桿菌可以將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香草醛和4-乙烯愈創(chuàng)木酚，可以對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行部分或者完全降解。在本試驗(yàn)中，阿氏芽孢桿菌對(duì)木質(zhì)素的降解未表現(xiàn)出最高的降解率。

作為革蘭氏陰性菌，鞘氨醇桿菌屬于鞘脂菌屬。段曉芹[21]在研究中通過對(duì)石油土壤的提煉，篩選出鞘氨醇桿菌BA3，由于動(dòng)植物的殘缺體是石油的原始來源，經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)受到石油污染的土壤以及部分植物均存在鞘氨醇桿菌，其能夠?qū)?-苯氧基苯甲酸起到降解作用，可以通過間接測(cè)定還原性糖的產(chǎn)量來確定[22]。在聯(lián)苯的代謝途徑中，通過一系列酶降解聯(lián)苯的代謝途徑研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇桿菌可降解聯(lián)苯，鞘氨醇桿菌可能也通過這樣的代謝途徑降解木質(zhì)素。

類動(dòng)膠杜搟氏菌屬于杜搟氏菌屬。劉曉蒨等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)田中進(jìn)行秸稈還田后土壤中除其他細(xì)菌外還有一定量的杜搟氏菌，杜搟氏菌菌群數(shù)量的增加會(huì)隨著添加秸稈的量而增加，在一定程度上反映了木質(zhì)素含量的增加促進(jìn)了杜搟氏菌的增加。在本試驗(yàn)中，類動(dòng)膠杜搟氏菌未表現(xiàn)出對(duì)木質(zhì)素最高的降解率。

3.2 苜蓿和燕麥干草菌劑處理效應(yīng)

XU等[24]使用堿性木質(zhì)素作為底物，研究菌株對(duì)木質(zhì)素的降解率，并測(cè)定菌株產(chǎn)生的漆酶、錳氧化物酶、過氧化物酶活性。不同類型干草中的木質(zhì)素含量不同使菌株表現(xiàn)出不同的差異。本研究表明，6株菌劑處理苜蓿干草和燕麥干草，對(duì)其飼喂價(jià)值產(chǎn)生一定的影響，干草在打捆時(shí)的含水量在20%~30%，此時(shí)含水量處于較低狀態(tài)或微生物產(chǎn)酶活性不佳的情況下，應(yīng)注意保證木質(zhì)素降解率與養(yǎng)分提高的程度。這與徐曉東等[25]研究的通過復(fù)合菌酶制劑對(duì)玉米秸稈的降解從而提高其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究結(jié)果比較符合，木質(zhì)素表現(xiàn)出較高的降解率，能夠很大程度上提高苜蓿干草的飼用價(jià)值。

本研究表明，除云南微球菌外，其他菌劑對(duì)苜蓿干草的營(yíng)養(yǎng)成分和飼喂價(jià)值均有一定程度的提高，其中，魯菲不動(dòng)桿菌表現(xiàn)出較好的結(jié)果，與該菌株的降解木質(zhì)素能力和產(chǎn)酶活性有關(guān)。木質(zhì)素過氧化物酶對(duì)木質(zhì)素降解是重要的，在木質(zhì)素過氧化物酶的作用下，堿性木質(zhì)素被降解一部分，不同微生物之間其產(chǎn)酶活力對(duì)苜蓿干草的營(yíng)養(yǎng)成分影響較大，細(xì)菌可以通過產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶和有機(jī)酸等來促進(jìn)木質(zhì)素的降解[26-27]。6種株菌可以有效降解聯(lián)苯類物質(zhì)、鄰苯二甲酸二丁酯類物質(zhì)等，其對(duì)堿性木質(zhì)素的降解主要是通過聯(lián)苯代謝途徑實(shí)現(xiàn)的，另外該機(jī)制也與DBP好氧途徑有關(guān)[28-30]。苜蓿干草經(jīng)過魯菲不動(dòng)桿菌的作用，其養(yǎng)分會(huì)得到相應(yīng)的提升，進(jìn)一步提升飼用價(jià)值。

由于燕麥干草的木質(zhì)素含量較低，在添加菌劑后沒有有效改善其含量，且對(duì)燕麥干草的品質(zhì)及其養(yǎng)分造成損失。燕麥干草的飼用價(jià)值均出現(xiàn)一定程度的降低。木質(zhì)素的降解率不僅僅與干草的種類、菌種有關(guān)，生長(zhǎng)的環(huán)境、降水量、紫外線輻射以及日照長(zhǎng)短等都會(huì)影響木質(zhì)素的最終降解程度。

4 結(jié)論

利用現(xiàn)代微生物技術(shù)，分別在苜蓿和燕麥干草調(diào)制時(shí)添加6株可以高效降解木質(zhì)素的菌劑，菌株在不同含量的木質(zhì)素干草中表現(xiàn)出差異，其中，魯菲不動(dòng)桿菌對(duì)苜蓿干草的營(yíng)養(yǎng)成分和飼用價(jià)值較其他5株菌表現(xiàn)較佳，從而顯著提升了苜蓿干草的營(yíng)養(yǎng)成分和飼喂價(jià)值。燕麥干草中的木質(zhì)素含量相對(duì)較低，在添加菌劑后未表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性。