肝癌細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因預(yù)后模型構(gòu)建與評估

孫東旭　朱文靜　金志朋　劉華元　朱朋程　史光軍

[摘要]目的基于細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因構(gòu)建新的肝癌預(yù)后模型，為預(yù)測肝癌的預(yù)后及腫瘤治療提供新的思路和方向。方法肝癌病人的mRNA表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)收集于TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫、GEO基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫和ICGC腫瘤基因數(shù)據(jù)庫。通過R軟件分析篩選肝癌的差異表達(dá)基因，并通過通路與基因功能富集（PPEA）方法確定與細(xì)胞周期相關(guān)的基因集。使用單因素Cox回歸分析和Kaplan-Meier曲線聯(lián)合確定與肝癌預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控基因，使用Lasso Cox回歸模型構(gòu)建和驗證肝癌預(yù)后模型。最后使用3對臨床樣本進(jìn)行二代測序驗證基因表達(dá)水平。結(jié)果通過差異篩選和基因富集分析以及單因素Cox回歸分析，找到24個細(xì)胞周期調(diào)控基因與肝癌病人預(yù)后相關(guān)（HR>1，F(xiàn)DR<0.05）。Lasso Cox回歸構(gòu)建的肝癌預(yù)后模型評估結(jié)果顯示，高風(fēng)險組的總生存期（OS）顯著小于低風(fēng)險組（TCGA-LIHC構(gòu)建隊列P<0.001，LIRI-JP驗證隊列P<0.001）;風(fēng)險評分是OS的獨(dú)立預(yù)后因素（HR>1，P<0.001）。臨床樣本測序結(jié)果驗證顯示，大部分肝癌細(xì)胞周期調(diào)控預(yù)后基因在肝癌組織中存在顯著高表達(dá)。結(jié)論本研究構(gòu)建了細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的肝癌病人預(yù)后模型，為肝癌病人的預(yù)后預(yù)測和治療提供新的思路和分子治療靶點。

[關(guān)鍵詞]癌，肝細(xì)胞;細(xì)胞周期;預(yù)后;計算生物學(xué);轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

[中圖分類號]R735.7[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0205-08

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.079[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220416.2316.004.html;2022-04-1919：41：29

CONSTRUCTION AND EVALUATION OF PROGNOSTIC MODEL FOR HEPATOCELLULAR CARCINOMA BASED ON CELL CYCLE REGULATION-ASSOCIATED GENES? SUN Dongxu， ZHU Wenjing， JIN Zhipeng， LIU Huayuan， ZHU Pengcheng， SHI Guangjun （Graduate School， Dalian Medical University， Dalian 116000， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo construct a new prognostic model for hepatocellular carcinoma （HCC） patients based on cell cycle regulation-associated genes， and to provide a new idea and method for predicting the prognosis and treatment of HCC. MethodsThe mRNA expression profile and clinical data of HCC patients were collected from TCGA， GEO， and ICGC databases. Differentially expressed genes were screened out using R software， and the gene sets related to cell cycle were identified by pathway and gene set enrichment analysis. Univariate Cox regression analysis and Kaplan-Meier curve were used to identify the cell cycle regulation genes associated with the prognosis of HCC. The Lasso Cox regression model was used to construct and verify the prognostic model of HCC. Finally， three pairs of clinical samples were subjected to next-generation sequencing to verify gene expression levels.ResultsThrough differential screening， gene enrichment analysis， and univariate Cox regression analysis， 24 cell cycle regulation genes were found to be associated with prognosis of HCC patients （HR>1， false discovery rate <0.05）. The prognostic model for HCC constructed by Lasso Cox regression showed that the overall survival （OS） of the high-risk group was significantly lower than that of the low-risk group （TCGA-LIHC cohort P<0.001， LIRI-JP cohort P<0.001）; risk score was an independent predictor of OS （HR>1，P<0.001）. The results of clinical sample sequencing showed that most of the cell cycle regulation genes associated with the prognosis of HCC were significantly overexpressed in HCC tissues. ConclusionIn this study， a prognostic model of HCC patients related to cell cycle regulation-associated genes was constructed， providing new ideas and molecular therapeutic targets for the prognostic prediction and treatment of HCC patients.

[KEY WORDS]carcinoma， hepatocellular; cell cycle; prognosis; computational biology; RNA-Seq

肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤，約占肝癌病人的90%[1]。盡管肝細(xì)胞癌的治療取得了一些進(jìn)展，但肝細(xì)胞癌病人的預(yù)后仍然很差[2]。既往生物信息學(xué)綜合性研究所構(gòu)建的肝癌預(yù)后模型等研究結(jié)果十分廣泛，包括基于免疫相關(guān)編碼基因集合[3]、p53相關(guān)的microRNA集合[4]等。但由于預(yù)后腫瘤標(biāo)志物和治療靶點尚未得到充分研究和臨床應(yīng)用，肝細(xì)胞癌病人的預(yù)后判斷和個體化診療仍是一大挑戰(zhàn)。本研究的目的是構(gòu)建預(yù)后模型，為肝癌病人的預(yù)后預(yù)測和個體化治療提供分子標(biāo)志物和新的方向。

1資料和方法

1.1肝癌轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)的獲取和差異表達(dá)基因的篩選

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載TCGA-LIHC肝癌數(shù)據(jù)集。TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌數(shù)據(jù)集包含374例肝細(xì)胞癌腫瘤組織樣本和50例癌旁正常肝組織樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。使用統(tǒng)計學(xué)軟件R軟件（3.6.1版）[5]和Bioconductor ‘edge’軟件包分析肝細(xì)胞癌樣本與正常組織間差異表達(dá)基因的表達(dá)差異[6-7]。|Log2FC|>2和校正后P值<0.05的基因被定義為差異表達(dá)基因。

從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[8]GPL10558平臺（Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip）下載肝癌數(shù)據(jù)集GSE36376。GSE36376數(shù)據(jù)集包含240例肝細(xì)胞癌組織樣本和193例癌旁組織樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。|Log2FC|>1和校正后P值<0.05的基因被鑒定為差異表達(dá)基因。使用維恩圖在線工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/） 繪制韋恩圖鑒定共同上調(diào)和下調(diào)基因。

從ICGC數(shù)據(jù)庫（https：//dcc.icgc.org/projects/LIRI-JP/）LIRI-JP肝癌數(shù)據(jù)集下載231例肝癌樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。這些樣本主要來自日本乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染人群[9]。樣本數(shù)據(jù)使用了標(biāo)準(zhǔn)化的計數(shù)值。

1.2肝癌差異表達(dá)基因的通路和功能富集分析

利用Metascape網(wǎng)站[10]對差異表達(dá)基因進(jìn)行通路和功能富集分析。基因GO功能注釋及基因參與通路來源于以下數(shù)據(jù)庫的并集：Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes （KEGG） Pathway， Gene Ontology （GO） Biological Processes， Reactome Gene Sets， Canonical Pathways， CORUM， TRRUST， DisGeNET， PaGenBase， Transcription Factor Targets， COVID。將基因組中的所有基因作為富集背景。P值的計算基于累積超幾何分布，q值的計算采用Benjamin-Hochberg （BH）進(jìn)行多重檢驗[11]。最后使用Cytoscape可視化網(wǎng)絡(luò)[12]。

1.3肝癌細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因預(yù)后模型的構(gòu)建和驗證

采用單因素Cox回歸分析細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)差異表達(dá)基因的預(yù)后價值。根據(jù)表達(dá)量的中位值將病人分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過在線Kaplan-Meier plotter （http：//kmplot.com/analysis/）進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線驗證[13]。使用Lasso Cox回歸分析方法建立預(yù)后模型[14-15]。采用‘glmnet R’包使用LASSO算法進(jìn)行選擇和收縮自變量。根據(jù)中位風(fēng)險評分將病人分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。基于模型中的基因表達(dá)，采用‘stats’R包的‘prcomp’程序進(jìn)行主成分分析（PCA）;同樣基于模型中的基因表達(dá)，采用‘Rtsne’R包中的t-分布隨機(jī)相鄰嵌入分析（t-SNE）方法，分析不同風(fēng)險組的分布，確定各風(fēng)險組的區(qū)分顯著性。采用‘survminer’ R包的‘sur_cutpoint’程序來確定最佳截斷表達(dá)值，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析確定高低風(fēng)險組的病人生存情況差異。使用單因素和多因素Cox回歸分析確定模型風(fēng)險評分是否為總生存期（OS）的獨(dú)立預(yù)后因素。應(yīng)用‘survival ROC’R包進(jìn)行時間依賴性受試者工作特征（ROC）曲線分析，以評估模型基因集的預(yù)測能力。生成用于模型可視化和臨床應(yīng)用的列線圖（Nomogram），應(yīng)用校準(zhǔn)曲線（Calibration curve）評價列線圖的校準(zhǔn)度，應(yīng)用決策曲線分析（DCA）評價臨床適用度。

1.4樣品采集和標(biāo)準(zhǔn)化處理

收集青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院肝膽外科3例確診為肝細(xì)胞癌病人的肝癌組織和癌旁組織，樣本采集和存儲采用標(biāo)準(zhǔn)化的方法。對組織樣本進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平二代測序（NGS），對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，統(tǒng)計方法采用Mann-Whitney U檢驗。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計分析均使用R軟件。除特殊標(biāo)注外，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ檢驗。應(yīng)用Cox回歸估計危險比（HR）和95%置信區(qū)間（CI）。生存分析采用Kaplan-Meier法，采用logrank檢驗確定差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。使用BH法校正P值。采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肝癌腫瘤組織和正常肝臟組織差異表達(dá)基因的篩選

TCGA數(shù)據(jù)庫TCGA-LIHC肝癌數(shù)據(jù)集共篩選出3 619個差異表達(dá)基因 （|logFC|>2， FDR<0.05），差異表達(dá)基因的熱圖和火山圖見圖1 A、B。 GEO數(shù)據(jù)庫GSE36376肝癌數(shù)據(jù)集共篩選出687個差異表達(dá)基因 （|logFC|>1， FDR<0.05）。應(yīng)用韋恩圖共同鑒定了141個差異表達(dá)基因，其中70個基因表達(dá)顯著上調(diào)，71個基因表達(dá)顯著下調(diào)。見圖1 C、D和表1。

2.2肝癌細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)預(yù)后基因的確定

通路及功能富集分析顯示，肝癌差異表達(dá)基因共參與了409個重要功能及通路（圖1），其中有95個通路和功能與肝癌細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，通過統(tǒng)計歸納，最后確定了28個與肝癌細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因。見表2。單因素Cox回歸分析顯示，與肝癌預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控基因有24個，其中包括CDC20、AURKA、NUSAP1、HMMR、TP2A和MDK等（HR>1，F(xiàn)DR<0.05）（圖2A）;基因表達(dá)熱圖顯示了這些基因的表達(dá)水平（FDR<0.05）（圖2B）。應(yīng)用在線Kaplan-Meier Plotter分析驗證肝癌病人細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的預(yù)后價值，最終確定這24個細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因均與肝癌病人的預(yù)后顯著相關(guān)（圖2C）。

2.3肝癌細(xì)胞周期調(diào)控基因預(yù)后模型的構(gòu)建

基于TCGA數(shù)據(jù)庫TCGA-LIHC肝癌病人隊列，用Lasso Cox回歸分析建立預(yù)后模型?；趹土P參數(shù)的最優(yōu)值λ，確定了一個8個基因的基因集（圖3）。風(fēng)險評分計算方法如下：風(fēng)險評分=e（0.319×CDC20表達(dá)量-0.393×NUSAP1表達(dá)量+0.438×HMMR表達(dá)量+0.066×ARID3A表達(dá)量+0.068×RACGAP1表達(dá)量+0.123×NCAPG表達(dá)量-0.141×SPC24表達(dá)量+0.004×MELK表達(dá)量）。根據(jù)其中位截斷值，將病人分為高風(fēng)險組（n=182）和低風(fēng)險組（n=183）（圖3A）。PCA和t-SNE分析顯示，高風(fēng)險組和低風(fēng)險組病人離散方向不同（圖3B、C），高風(fēng)險病人早期死亡的可能性高于低風(fēng)險病人（圖3D）。Kaplan-Meier曲線分析顯示，高風(fēng)險組的OS明顯低于低風(fēng)險組（圖3E，P<0.001），低風(fēng)險評分的肝癌病人較高風(fēng)險評分者有更好的預(yù)后。應(yīng)用ROC曲線評估模型的預(yù)測能力，生存時間1年的ROC曲線下面積（AUC）為0.800（95%CI=0.737～0.863），2年為0.750（95%CI=0.687～0.813），3年AUC為0.731（95%CI=0.659～0.804），表明本文建立的預(yù)后模型具有良好的預(yù)后預(yù)測準(zhǔn)確度和特異度（圖3F）。利用TCGA隊列中多因素Cox回歸模型生成的系數(shù)，將風(fēng)險評分與分期、分級、年齡和性別等重要的臨床變量整合在一起，以進(jìn)一步提高預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性，建立了模型可視化和臨床應(yīng)用的列線圖（圖4A）。校準(zhǔn)曲線檢測出列線圖預(yù)測與實際觀測之間的最佳預(yù)測閾值（圖4B）。最后，通過1、2和3年的DCA比較風(fēng)險評分與其他臨床指標(biāo)的臨床凈效益（圖4C～E），結(jié)果顯示，在上述閾值概率的大部分范圍內(nèi)，風(fēng)險評分顯示出更大的凈收益，表明風(fēng)險評分在預(yù)測肝癌病人預(yù)后方面具有較好的臨床應(yīng)用價值。

2.4肝癌細(xì)胞周期調(diào)控基因預(yù)后模型的驗證

為了檢驗肝癌病人隊列模型的穩(wěn)健性，按照與TCGA數(shù)據(jù)庫TCGA-LIHC肝癌病人隊列構(gòu)建模型的相同公式，將ICGC數(shù)據(jù)庫LIRI-JP肝癌病人隊列分為高風(fēng)險組（n=182）和低風(fēng)險組（n=78）（圖5A）。PCA分析和t-SNE分析確定了病人在兩個亞組中離散方向的分布，見圖5B、C。與低風(fēng)險組相比，高風(fēng)險組病人早期死亡可能性更高（圖5D），生存時間更短（圖5E，P<0.001）。ROC曲線分析顯示，生存時間1年的AUC為0.722（95%CI=0.584～0.861），2年為0.739（95%CI=0.633～0.845），3年為0.733（95%CI=0.627～0.839），預(yù)后模型具有良好的預(yù)測準(zhǔn)確度和特異度（圖5F）。

2.5肝癌細(xì)胞周期調(diào)控基因預(yù)后模型風(fēng)險評分的獨(dú)立預(yù)后價值

單因素Cox回歸分析顯示，TCGA-LIHC肝癌病人隊列（構(gòu)建隊列）和LIRI-JP肝癌病人隊列（驗證隊列）的風(fēng)險評分與OS之間存在顯著相關(guān)性（構(gòu)建隊列：HR=3.767，95%CI=2.661～5.333，P<0.001;驗證隊列：HR=3.752，95%CI=2.240～6.266，P<0.001）。多因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險評分是OS的獨(dú)立預(yù)測因子（TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌病人隊列：HR=3.436，95%CI=2.402～4.916，P<0.001;ICGC數(shù)據(jù)庫肝癌病人隊列：HR=3.264，95%CI=1.920～5.549，P<0.001）。見圖6。

2.6肝癌細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)預(yù)后基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平鑒定

本文NGS結(jié)果顯示，包括CDC20、AURKA和NUSAP1等在內(nèi)的16個細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)預(yù)后基因在肝癌中表達(dá)顯著上調(diào)（圖7）。

3討論

肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞的特點是無限增殖，這與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。盡管細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制已經(jīng)成為腫瘤研究的核心領(lǐng)域，但其具體機(jī)制仍不明確，細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制以及相關(guān)基因?qū)Ω伟┎∪祟A(yù)后的預(yù)測價值也尚不清楚。既往的研究結(jié)果表明，基于p53相關(guān)的microRNA集合[5]、免疫相關(guān)編碼基因集合[4]、CpG島甲基化表型（CIMP）相關(guān)基因[16]、控制胚胎發(fā)育的claudin基因家族[17]等構(gòu)建的肝癌預(yù)后模型顯示了優(yōu)秀的預(yù)測能力。與這些研究相比，本研究1、2、3年的ROC曲線及DCA曲線等結(jié)果均顯示本文構(gòu)建的預(yù)后模型具有良好的準(zhǔn)確性、特異性及臨床適用性，能夠準(zhǔn)確預(yù)測肝癌病人的預(yù)后。

本文構(gòu)建的預(yù)后模型中，參與模型的共有8個細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因，分別為RACGAP1、CDC20、NUSAP1、HMMR、ARID3A、NCAPG、SPC24和MELK。迄今為止的研究顯示，其中6個致癌基因CDC20[18]、NUSAP1[19]、RACGAP1[20-21]、NCAPG[22]、MELK[23]和SPC24[24]已經(jīng)在肝癌中被確定具有重要作用，但HMMR和ARID3A在肝癌中的作用尚不清楚。有生物信息學(xué)研究結(jié)果表明，HMMR可能是肝癌中較高表達(dá)的致癌基因[25]。本文研究表明，HMMR可能通過調(diào)控肝癌細(xì)胞周期影響病人的預(yù)后。此外，ARID3A基因在腫瘤中作用研究甚少，本文研究顯示ARID3A可能通過調(diào)控細(xì)胞周期影響肝癌病人的預(yù)后。為了驗證本文篩選出的預(yù)后基因的表達(dá)水平，我們使用NGS技術(shù)檢測3例肝癌組織與癌旁組織基因表達(dá)，結(jié)果顯示16個細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)預(yù)后基因在肝癌中表達(dá)顯著上調(diào)，在轉(zhuǎn)錄水平上證明了細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)預(yù)后基因的作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的預(yù)后模型，為肝癌病人的預(yù)后及治療提供新的方向。本文測序分析為后續(xù)的模型驗證提供了轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，但仍需檢測更多的組織樣本進(jìn)行驗證，并進(jìn)行更加深入的基礎(chǔ)實驗研究。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）