不同文件中多項(xiàng)回歸分析線性驗(yàn)證異同分析

朱嶺峰， 吳海洋， 章雪瑜， 朱宇清

（1.深圳昭藍(lán)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518000；2.上海科華生物工程股份有限公司，上海 200233；3.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

2019年，中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）發(fā)布了CNASGL037《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》，推薦采用多項(xiàng)回歸分析來(lái)驗(yàn)證線性區(qū)間。而最為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所熟知的多項(xiàng)回歸分析驗(yàn)證線性區(qū)間的文件分別為WS/T 408-2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評(píng)價(jià)指南》（簡(jiǎn)稱WS/T 408—2012）和美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2003年發(fā)布的 EP06-A文件，2個(gè)文件要求的線性區(qū)間驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本制備與測(cè)定等具體操作步驟沒(méi)有明顯差別。但當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)非線性關(guān)系時(shí)，對(duì)于臨床可接受允許偏差的計(jì)算方式完全不同，WS/T 408—2012要求評(píng)估整個(gè)稀釋范圍的非線性程度，CLSI EP06-A文件要求評(píng)估每個(gè)稀釋濃度的非線性程度。

WS/T 408—2012介紹的方法由KROLL等[1]提出，并在美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（the College of American Pathologists，CAP）的校準(zhǔn)驗(yàn)證和線性評(píng)估（calibration verification and linearity program，CVL）中使用多年；CLSI EP06-A文件在CLSI EP06-P文件和CAP線性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)不斷實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，被認(rèn)為是目前最好的線性評(píng)價(jià)方法[2]。但無(wú)論是WS/T 408—2012，還是EP06-A文件，在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際使用的過(guò)程中均仍然存在一些問(wèn)題。本文以驗(yàn)證雌二醇（estradiol，E2）項(xiàng)目的線性范圍為例進(jìn)行分析。

收集足量高值（H）、低值（L）2份標(biāo)本，按L、0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、H配制成6個(gè)不同濃度的系列樣品，每個(gè)樣品在某化學(xué)發(fā)光儀上隨機(jī)測(cè)定3次，在1 d內(nèi)完成。結(jié)果記錄見(jiàn)表1。

表1 E2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

首先確定實(shí)驗(yàn)方法可接受的不精密度、線性偏差或非線性程度的允許誤差范圍，該項(xiàng)目的線性偏差均設(shè)定為1/3 允許總誤差（allowable total error，TEa）。目測(cè)有無(wú)明顯離群值，如有，查找原因并解決。

采用多項(xiàng)式回歸分析，計(jì)算不精密度（WS/T 408—2012與CLSI EP06-A文件中關(guān)于驗(yàn)證精密度的內(nèi)容不同，但本研究不做討論），符合要求后，將測(cè)定數(shù)據(jù)分別擬合一次多項(xiàng)式（b0+b1X）、二次多項(xiàng)式（b0+b1X+b2X2）和三次多項(xiàng)式（b0+b1X+b2X2+b3X3），根據(jù)t值判斷擬合曲線的非線性系數(shù)（b2和b3）與0的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如有，則判斷為非線性；無(wú)，則為線性。當(dāng)存在非線性時(shí)，以回歸分析標(biāo)準(zhǔn)誤最小者為最適多項(xiàng)式。

當(dāng)初步判斷為非線性時(shí)，按WS/T 408—2012要求計(jì)算最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值（average deviation from linearity，ADL），計(jì)算公式為：

式中P（x）為最適多項(xiàng)式在每個(gè)稀釋濃度處的估計(jì)值，b0+b1X為擬合線性（直線）模型在每個(gè)濃度處的估計(jì)值，n為樣本數(shù)與測(cè)定次數(shù)的乘積，為所有測(cè)定濃度測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值。ADL應(yīng)小于查表獲得的ADL臨界值，否則判斷為臨床不可接受的非線性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2、表3、圖1。

表2 多項(xiàng)回歸分析結(jié)果

表3 非線性程度判斷（WS/T408—2012）

圖1 E2多項(xiàng)回歸線性擬合圖

當(dāng)初步判斷為非線性時(shí)，按CLSI EP06-A文件要求計(jì)算線性偏差，計(jì)算公式為：DLi=P（x）-（b0+b1x），式中P（x）為最適多項(xiàng)式在每個(gè)稀釋濃度處的估計(jì)值，b0+b1X為擬合線性（直線）模型在每個(gè)濃度處的估計(jì)值。每個(gè)點(diǎn)DLi均應(yīng)小于設(shè)定誤差，否則判斷為臨床不可接受的非線性。如需要換算成百分比，則將每DLi÷該濃度的測(cè)量均值，再×100%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4、圖1。

表4 非線性程度判斷（CLSI EP06-A文件）

可以看到，按照不同的文件要求計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到的結(jié)論截然相反。為了得到更為直觀的結(jié)論，可以按照平均斜率法和逐步直線回歸統(tǒng)計(jì)法[3]處理數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5、圖2。

圖2 E2平均斜率法回歸圖

表5 平均斜率法和逐步直線回歸統(tǒng)計(jì)結(jié)果

通過(guò)逐步直線回歸統(tǒng)計(jì)可以發(fā)現(xiàn)，從第4個(gè)點(diǎn)開(kāi)始斜率已經(jīng)不符合平均斜率法的要求（b1=1±0.03），所以判斷該范圍內(nèi)呈非線性。按WS/T 408—2012的方法，該項(xiàng)為臨床可接受的非線性；而按CLSI EP06-A文件的方法，則為臨床不可接受的非線性。但是通過(guò)平均斜率法進(jìn)行直觀的判斷，可以發(fā)現(xiàn)該項(xiàng)目為非線性。

盡管WS/T408—2012也提到參考CLSI EP06-A文件，采用了多項(xiàng)式法進(jìn)行線性評(píng)價(jià)，但對(duì)非統(tǒng)計(jì)學(xué)線性的情況進(jìn)行臨床線性的評(píng)估則是采用KROLL等[1]提出的最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值，即ADL。從ADL計(jì)算公式中可以發(fā)現(xiàn)，其反映的是最優(yōu)擬合曲線與直線離散程度，因?yàn)樵摴降哪Ｐ途褪菢?biāo)準(zhǔn)差公式的模型，所以WS/T408—2012評(píng)估的是全部稀釋范圍的非線性程度，個(gè)別稀釋濃度點(diǎn)的非線性由于計(jì)算ADL而被忽略了[4]，這一方案也被CAP運(yùn)用于其線性評(píng)估和校準(zhǔn)驗(yàn)證的調(diào)查。

CLSI EP06-A文件的線性評(píng)價(jià)方法也存在不足：（1）計(jì)算線性偏差時(shí)是采用最適多項(xiàng)式與直線回歸（并非測(cè)量均值）估計(jì)值的差值來(lái)表達(dá)，但是偏差的目標(biāo)并未明確，僅要求實(shí)驗(yàn)室必須確定自己的測(cè)量誤差目標(biāo)；（2）直線回歸對(duì)于呈曲線表示的數(shù)據(jù)時(shí)，降低了斜率，又增加了截距，往往使低濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)常處在回歸直線之下，直線回歸線上的估計(jì)值明顯偏高，導(dǎo)致有些數(shù)據(jù)點(diǎn)的最適多項(xiàng)式與直線回歸估計(jì)值的差異過(guò)高，得出非線性的結(jié)論。

在CAP的介紹中可發(fā)現(xiàn)，目前的CVL的調(diào)查相較于WS/T408—2012有了較大的變化：（1）修改了偏差的目標(biāo)；（2）增加了各個(gè)稀釋點(diǎn)的非線性的判斷。在方法評(píng)估中，公認(rèn)的做法是指定TEa，并按比例分配總誤差用于偏差的目標(biāo)，通常，在CVL調(diào)查中，1/2TEa用于校準(zhǔn)驗(yàn)證，1/4TEa用于線性評(píng)估[5]。同時(shí)，在計(jì)算ADL的基礎(chǔ)上，增加了對(duì)每個(gè)檢測(cè)值與最適直線回歸的差值計(jì)算，并且要求差值＜1/4TEa。

綜上所述，合適的線性范圍既可以反映該范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果真實(shí)的比例關(guān)系，也可避免不必要的稀釋操作，是僅次于精密度的重要指標(biāo)。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)認(rèn)識(shí)到實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)是第1位的，任何統(tǒng)計(jì)方法都可能因存在缺陷而產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論。臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理職能部門除組織常規(guī)的能力驗(yàn)證活動(dòng)外，也可以嘗試提供線性驗(yàn)證和校準(zhǔn)驗(yàn)證的調(diào)查，以便更全面地反映實(shí)驗(yàn)室各檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)水平，提高檢測(cè)質(zhì)量，更好地為臨床診斷服務(wù)。