外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

俞 琦， 孫 懿， 王瓊麗， 蔡逸婷， 李 莉

（1.上海市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200080；2.保山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 保山 678000）

隨著現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，無(wú)創(chuàng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）檢測(cè)方法的敏感性和特異性不斷提高，其在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值得到越來(lái)越多的重視。2000年，VONA等[1]首次利用CTC和正常血液細(xì)胞大小、形態(tài)等物理學(xué)差異和腫瘤細(xì)胞特有的形態(tài)特征，建立了上皮腫瘤細(xì)胞大小分離法（isolation by the size of epithelial tumor cell，ISET ），在外周血中通過(guò)顯微鏡檢出CTC。此項(xiàng)技術(shù)能完整地檢出各種表型的CTC，且快速、便捷、成本低，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)和研究的開(kāi)展[2]。目前的主流富集技術(shù)中，免疫學(xué)技術(shù)缺乏廣譜且高特異性的腫瘤標(biāo)志物，會(huì)造成異質(zhì)性CTC無(wú)法檢出，ISET技術(shù)的缺點(diǎn)在于一些較大的單核細(xì)胞等容易與CTC混在一起，而一些較小的CTC容易被濾過(guò)而無(wú)法檢測(cè)到[2]。因此，目前還沒(méi)有一種方法可以完美地捕捉到循環(huán)中所有的CTC[3]。在CTC鑒定技術(shù)方面，免疫學(xué)仍然存在標(biāo)志物特異性問(wèn)題，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)靈敏度高，但不能觀察到完整細(xì)胞；而形態(tài)學(xué)方法具有快速、直觀、成本低等優(yōu)勢(shì)。本研究采用獲得中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的CTCBIOPSY異常細(xì)胞分離染色系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)6類(lèi)我國(guó)常見(jiàn)腫瘤患者外周血CTC的檢出情況，分析這種基于ISET技術(shù)和形態(tài)學(xué)判讀標(biāo)準(zhǔn)的CTC檢測(cè)技術(shù)在腫瘤臨床檢驗(yàn)及科學(xué)研究中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年4月—2020年1月上海市第一人民醫(yī)院初次手術(shù)后經(jīng)病理檢測(cè)確診的腫瘤患者，排除既往接受過(guò)腫瘤醫(yī)療干預(yù)，或合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能疾病患者，納入212例腫瘤患者，其中肺癌患者72例、腸癌患者46例、胃癌患者38例、甲狀腺癌患者24例、乳腺癌患者18例、前列腺癌患者14例。TNM分期：原位癌3例、Ⅰ期45例、Ⅱ期55例、Ⅲ期55例、Ⅳ期54例。所有研究對(duì)象年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。本研究通過(guò)上海市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（倫理批件編號(hào)：2018KY177），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 在患者手術(shù)或進(jìn)行化療治療前，采用乙二胺四乙酸抗凝（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）真空采血管采集其肘靜脈血5 mL。為避免采血過(guò)程中發(fā)生上皮細(xì)胞污染，采用第2管之后抽取的血液標(biāo)本用于CTC檢測(cè)。采血后，上下顛倒采血管，使血液與抗凝劑成分充分混合，血液標(biāo)本在采集后2 h內(nèi)處理。

1.2.2 標(biāo)本前處理 用1 mL 75%醫(yī)用乙醇潤(rùn)洗濾器（武漢友芝友公司），再用2 mL 0.9%Nacl溶液漂洗3次。向15 mL離心管中加入3 mL 0.9%Nacl溶液和200 μL固定劑（8% PFA）混勻，再加入5 mL血液標(biāo)本顛倒混勻，室溫固定10 min，然后將待測(cè)標(biāo)本加入濾器中，采用CTCBIOPSY異常細(xì)胞分離染色儀（武漢友芝友公司）檢測(cè)。

1.2.3 制片 分離完成后，取出濾器，向?yàn)V器內(nèi)加入300 μL甲醇，室溫固定1 min后取出濾膜，將濾膜貼于玻片中央，室溫晾干后進(jìn)行瑞-吉染色，50 ℃干燥箱放置30 min，滴加100%甘油封片后，進(jìn)行鏡檢。

1.2.4 油鏡觀察 富集細(xì)胞形態(tài)評(píng)判參數(shù)[4-5]：（1）細(xì)胞核異型性，呈不規(guī)則的結(jié)節(jié)狀、分葉狀等；（2）核質(zhì)比＞0.8；（3）細(xì)胞直徑（長(zhǎng)端）＞15 μm；（4）核深染且著色不均勻；（5）核膜增厚，出現(xiàn)凹陷或皺褶，核膜呈鋸齒狀；（6）細(xì)胞核染色質(zhì)邊移，或巨大核仁，或異常核分裂。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[5]：（1）4個(gè)或4個(gè)以上參數(shù)符合判讀為CTC；（2）滿(mǎn)足評(píng)判參數(shù)（6）外的任意3個(gè)條件或單獨(dú)滿(mǎn)足評(píng)判參數(shù)（6）判讀為疑似CTC；（3）3個(gè)及以上的細(xì)胞成團(tuán)，且能鑒定為CTC，但因相互連接重疊無(wú)法準(zhǔn)確判讀為CTC的細(xì)胞團(tuán)，判讀為循環(huán)腫瘤微栓（circulating tumor microemboli，CTM）；（4）3個(gè)及以上的細(xì)胞成團(tuán)，但不足以判定為CTC的細(xì)胞團(tuán)，判讀為疑似CTM；（5）不能判斷為血液來(lái)源的細(xì)胞，但同時(shí)也不符合上述4種類(lèi)型的其他細(xì)胞，判讀為非血液細(xì)胞。計(jì)數(shù)判讀為CTC、疑似CTC、CTM和疑似CTM的細(xì)胞數(shù)量，并記錄坐標(biāo)。

1.2.5 免疫組化檢測(cè) 鏡檢后，將玻片放入去離子水中上下潤(rùn)洗去除甘油，依次放入100%乙醇（1 min）、95%乙醇（1 min）、75%乙醇（＞20 min），在去離子水中潤(rùn)洗脫色。然后分別滴加100 μL 0.1% Triton X-100，室溫孵育15 min，洗凈后滴加100 μL 0.3% H2O2，室溫（18～26 ℃）孵育10 min，洗凈后分別加入100 μL CD45一抗（美國(guó)Abcam公司）和100 μL CD31一抗（美國(guó)Abcam公司），室溫（18～26 ℃）孵育2 h（或4 ℃過(guò)夜）。洗凈后加入100 μL山羊抗兔/小鼠IgG/HRP（上海威奧生物公司），室溫（18～26 ℃）孵育20 min。洗凈后滴加100 μL DAB顯色液顯色3～10 min，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化8 s，自來(lái)水返藍(lán)5 min。采用75%乙醇（1 min）、95%乙醇（1 min）、100%乙醇（1 min）梯度脫水，晾干，用中性樹(shù)脂封固，于CX23光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下鏡檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R軟件（3.5.0版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布（檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為0.10）。正態(tài)分布連續(xù)變量采用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的連續(xù)變量采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。分類(lèi)變量的比較采用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)變量先進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換后，再用Mann-Whiney U檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血CTC形態(tài)學(xué)檢出情況

細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果顯示，212例腫瘤患者外周血標(biāo)本中有88例（41.51%）檢出CTC，其中16例檢出CTM。進(jìn)一步通過(guò)CD45和CD31抗體同時(shí)進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)所有檢出CTC和CTM者CD45、CD31均為陰性，符合CTC和CTM免疫學(xué)特征。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血CTC及CTM形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果

2.2 CTC陽(yáng)性組與陰性組各項(xiàng)參數(shù)比較

CTC陽(yáng)性組與陰性組患者性別以及是否患糖尿病、高血壓和腫瘤類(lèi)型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；年齡（P＜0.05）、腫瘤原發(fā)灶（tumor，T）、區(qū)域淋巴結(jié)受累（node，N）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（metastasis，M）及TNM分期（P＜0.001）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 CTC陽(yáng)性組與陰性組各項(xiàng)參數(shù)比較

2.3 不同類(lèi)型或不同分期腫瘤患者CTC檢出率比較

72例肺癌患者中，有34例（47.22%）檢出CTC，早期（Ⅰ、Ⅱ期）患者和中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者檢出率分別為9.68%和75.61%；46例腸癌患者中，有21例（45.65%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為33.33%和53.57%；38例胃癌患者中，14例（36.84%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為27.78%和45.00%；24例甲狀腺癌患者中，5例（20.83%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為11.11%和50.00%；18例乳腺癌患者中，7例（38.89%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為35.71%和50.00%；14例前列腺癌患者中，7例（50.00%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為16.67%和75.00%。見(jiàn)圖2。

圖2 不同類(lèi)型腫瘤患者不同分期CTC檢出率

2.4 不同類(lèi)型腫瘤患者不同分期CTC計(jì)數(shù)比較

不同類(lèi)型腫瘤早期與中晚期患者CTC計(jì)數(shù)有一定差異。30例肺癌早期（Ⅰ+Ⅱ期）患者CTC計(jì)數(shù)為（0.80±0.58）個(gè)/5 mL，顯著低于42例肺癌晚期（Ⅲ+Ⅳ期）患者[（8.64±1.88）個(gè)/5 mL]（P＜0.01）；6例前列腺癌早期（Ⅰ+Ⅱ期）患者CTC計(jì)數(shù)為（2±2）個(gè)/5 mL，顯著低于8例前列腺癌晚期（Ⅲ+Ⅳ期）患者[（24.63±11.71）個(gè)/5 mL]（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 不同類(lèi)型腫瘤患者不同分期CTC計(jì)數(shù)比較

3 討論

本研究采用基于ISET的形態(tài)學(xué)方法在212例腫瘤患者中檢出88例CTC陽(yáng)性。為了進(jìn)一步評(píng)估該形態(tài)學(xué)CTC檢測(cè)方法的特異性，本研究通過(guò)CD45抗體免疫組化檢測(cè)排除形態(tài)學(xué)特征類(lèi)似CTC的白細(xì)胞，通過(guò)CD31抗體免疫組化檢測(cè)排除形態(tài)特征類(lèi)似CTC或CTM的血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而驗(yàn)證形態(tài)學(xué)技術(shù)CTC檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性率。細(xì)胞核染色為藍(lán)色（蘇木素） 且細(xì)胞膜染色為棕黃色（DAB） 即CD45或CD31陽(yáng)性，為血液細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞；而細(xì)胞核染色為藍(lán)色（蘇木素）且細(xì)胞膜周?chē)鸁o(wú)棕黃色即CD45陰性且CD31陰性，為CTC或CTM（圖1）。通過(guò)免疫組化驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)檢出的所有CTC和CTM細(xì)胞均符合CD45-CD31-的免疫學(xué)特征，說(shuō)明該CTC形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法和判讀標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)特異性較高。

本研究檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)了6種我國(guó)常見(jiàn)癌癥的CTC，總體檢出率為41.51%，其中前列腺癌CTC檢出率（50%，7/14）最高，肺癌（47.22%，34/72）次之，以下依次為腸癌（45.65%，21/46）、乳腺癌（38.89%，7/18）、胃癌（36.8%，14/38）、甲狀腺癌（20.83%，5/24）。同一類(lèi)型癌癥，采用不同檢測(cè)方法，CTC的敏感性和特異性不盡相同[6]。如，在可切除非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，應(yīng)用CellSearch可在19%～39%的患者中檢出CTC，采用ISET能在36%～50%的患者中檢出CTC[7]。迄今為止，尚沒(méi)有發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異靶標(biāo)，最具代表性的CellSearch技術(shù)，其標(biāo)志物EpCAM是上皮細(xì)胞的標(biāo)志，當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)，則無(wú)法檢出[8]。與基于表面標(biāo)志物的免疫親和吸附技術(shù)比較，本研究采用的方法可以減少腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中表面標(biāo)志物表達(dá)變化的影響，提高CTC和CTM的檢測(cè)效率。本研究采用的方法對(duì)CTC無(wú)選擇性，并能較完整地保留細(xì)胞成分，可用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和基因多樣性等研究，經(jīng)濟(jì)、快捷，適合大批量標(biāo)本的檢測(cè)，有較好的臨床和科研應(yīng)用前景。然而，盡管CTC形態(tài)上比正常組織細(xì)胞的體積稍大，且不易變形，但極少量的微小CTC（直徑＜8 μm）可能無(wú)法被富集，這是本技術(shù)的不足之處。

本研究患者相關(guān)臨床參數(shù)比較結(jié)果顯示，CTC陽(yáng)性組T4期患者、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處血行轉(zhuǎn)移患者所占比例較陰性組顯著增多（表1）。轉(zhuǎn)移性癌癥患者外周血中CTC的頻率約為每105～107個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中有1個(gè)CTC，高于局限性癌癥患者108個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中有1個(gè)CTC的頻率[9]。本研究免疫組化驗(yàn)證結(jié)果顯示，CTC形態(tài)學(xué)分析技術(shù)在發(fā)生淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移性的中晚期癌癥患者外周血中檢出CTC的頻率更高?；仡櫼酝芯浚覀儼l(fā)現(xiàn)采用不同技術(shù)檢測(cè)CTC時(shí)，不同腫瘤患者臨床病理特征的關(guān)系不盡相同。一項(xiàng)納入84例胃癌患者的ISET技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CTC和CTM檢出情況與瘤塊大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)血管侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶有關(guān)[10]；而另一項(xiàng)采用陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交技術(shù)的針對(duì)32例胃癌患者和36例結(jié)直腸癌患者的研究則發(fā)現(xiàn)，CTC檢出結(jié)果與胃癌和結(jié)直腸癌患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)均無(wú)相關(guān)性[11]。檢測(cè)方法學(xué)、樣本數(shù)量和研究群體的差異可能造成了上述差異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，CTC陽(yáng)性組平均年齡較陰性組大，以往未見(jiàn)類(lèi)似報(bào)道，考慮到可能存在抽樣誤差，還需擴(kuò)大檢測(cè)樣本量和檢測(cè)人群，以進(jìn)一步驗(yàn)證。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，9.4%～48.6%的早期乳腺癌患者體內(nèi)可以檢出CTC，且提示早期復(fù)發(fā)和總生存期降低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤早期，乳腺癌的CTC檢出率最高（35.71%），腸癌、胃癌、前列腺癌依次降低，早期肺癌和甲狀腺癌CTC檢出率較低，肺癌和前列腺癌早期患者CTC計(jì)數(shù)與中晚期患者比較差異顯著，提示本研究采用的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法可以捕捉早期腫瘤患者外周血中的CTC，特別是在早期乳腺癌、腸癌和胃癌患者外周血中更易檢出，這可能與不同類(lèi)型腫瘤不同時(shí)期外周血中CTC的豐度有關(guān)。

縱觀不同CTC檢測(cè)方法在不同類(lèi)型腫瘤以及相同類(lèi)型腫瘤的不同分期的廣泛的臨床研究，CTC檢測(cè)方法的敏感度、特異性、精確性和可重復(fù)性仍難以客觀判斷，目前還很難將單純的CTC定性檢測(cè)和計(jì)數(shù)運(yùn)用到臨床決策[3]。值得欣喜的是，CTC的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠克服CTC的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中新的驅(qū)動(dòng)基因，揭示腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)等機(jī)制[13]。對(duì)單個(gè)CTC或CTM癌基因和抑癌基因的鑒定、腫瘤生存分子的分析是未來(lái)研究的趨勢(shì)[14]。本研究采用的CTC形態(tài)學(xué)分析技術(shù)在單個(gè)CTC及CTM細(xì)胞的捕獲和鑒定方面具有經(jīng)濟(jì)、特異性高、操作快速、高通量且細(xì)胞完整等優(yōu)勢(shì)，在6類(lèi)常見(jiàn)腫瘤的早、晚期均可檢出CTC，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，未來(lái)可以結(jié)合細(xì)胞顯微切割、單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)，針對(duì)單病種，結(jié)合療效和預(yù)后評(píng)估等，開(kāi)展更深入的研究。