CLSI EP06-Ed2文件在定量測(cè)量程序線性驗(yàn)證中的應(yīng)用

李曉博， 普智飛， 吳曉琪， 劉洋洋， 謝軒波， 單漢明， 于嘉屏

（杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 杭州 310030）

在給定的測(cè)量區(qū)間內(nèi)，當(dāng)測(cè)定結(jié)果與樣本中被測(cè)物真實(shí)的量值成比例時(shí)，測(cè)量程序是線性的[1]，此測(cè)定結(jié)果指最終的分析結(jié)果，而不是儀器輸出的原始信號(hào)[2]。測(cè)定結(jié)果與真實(shí)的量值存在比例關(guān)系，線性測(cè)量程序有助于揭示疾病的嚴(yán)重性與真實(shí)量值之間的關(guān)系。在臨床診療中，臨床醫(yī)生可以根據(jù)患者樣本測(cè)定結(jié)果的變化進(jìn)行決策。線性對(duì)于定量測(cè)量的程序和分析方法極為重要，是方法學(xué)性能評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一[3]。2003年，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）發(fā)布了EP06-A文件，作為線性評(píng)價(jià)指南EP06-P文件的更新版本[4]。EP06-A文件主要通過(guò)多項(xiàng)式回歸分析，檢查非線性模型是否比線性模型更適合于數(shù)據(jù)組，然后評(píng)價(jià)最適非線性模型與線性模型每個(gè)點(diǎn)的差值是否小于該方法所允許的偏差。2013年，我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布了推薦性衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 408—2012[2]，為臨床實(shí)驗(yàn)室建立和驗(yàn)證線性提供指引，其評(píng)價(jià)方案與EP06-A類似。2019年，中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）也發(fā)布了關(guān)于線性驗(yàn)證的指南文件CNAS—GL038：2019[5]。目前，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行定量測(cè)量程序的線性驗(yàn)證也多參考這些指南[6-9]。2020年，CLSI發(fā)布了EP06-A文件的更新版本，即EP06-Ed2文件[1]，對(duì)定量測(cè)量程序線性區(qū)間的確認(rèn)或驗(yàn)證程序、評(píng)價(jià)樣本準(zhǔn)備、數(shù)據(jù)分析處理、結(jié)果解釋等方面作了較大調(diào)整。本研究以三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）項(xiàng)目為例，探討CLSI EP06-Ed2文件在定量測(cè)量程序線性驗(yàn)證中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

i3000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（四川邁克公司）及配套T3試劑盒、FT3試劑盒、校準(zhǔn)品。T3和FT3試劑盒說(shuō)明書中聲明的線性區(qū)間分別為0.4～15.36 nmol/L和1～50 pmol/L。依據(jù)我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，T3和FT3的總允許誤差（allowable total error，TEa）均設(shè)定為25%。本研究在進(jìn)行線性驗(yàn)證前已對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度和正確度進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果均滿足實(shí)驗(yàn)室要求。

1.2 方法

1.2.1 樣本準(zhǔn)備 每個(gè)項(xiàng)目分別選擇接近線性區(qū)間上限和下限的2個(gè)樣本，將高濃度樣本標(biāo)記為H，低濃度樣本標(biāo)記為L(zhǎng)，按5/6H+1/6L、4/6H+2/6L、3/6H+3/6L、2/6H+4/6L、1/6H+5/6L比例混合得到5個(gè)中間濃度的樣本，最終7個(gè)樣本按濃度由高到低依次標(biāo)記為1～7號(hào)。每個(gè)濃度的樣本各重復(fù)檢測(cè)2次。所有樣本在1個(gè)批次內(nèi)完成檢測(cè)。為避免樣本引入的攜帶污染影響，隨機(jī)安排樣本的檢測(cè)順序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)線性組合樣本中每個(gè)樣本2次重復(fù)測(cè)定的均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s），以s為自變量，x 為因變量，建立未加權(quán)、斜率為b0、截距為0的回歸方程Y=b0X。計(jì)算西格瑪（sigma，σ）值，公式為：σ=×b0。計(jì)算每個(gè)x的權(quán)重，公式為：權(quán)重=1/σ2。以每個(gè)樣本中高值樣本所占比例（P），即1、5/6、4/6、3/6、2/6、1/6、0為自變量，測(cè)量結(jié)果的為因變量，進(jìn)行加權(quán)最小二乘（weighted least square，WLS）線性回歸，其中最低濃度的權(quán)重按1/s計(jì)算，回歸方程為：Y=bX+a。根據(jù)回歸方程計(jì)算每個(gè)樣本的預(yù)期值，并計(jì)算線性偏差，公式為：線性偏差=-預(yù)期值。按公式1、公式2計(jì)算線性偏差的95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。

1.2.3 結(jié)果判斷 當(dāng)所有樣本線性偏差的95%CI與ADL相交時(shí)，整個(gè)區(qū)間的線性是可接受的，即線性區(qū)間得到驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)處理過(guò)程中不對(duì)中間結(jié)果做修約處理。

2 結(jié)果

2.1 T3和FT3檢測(cè)結(jié)果分析及加權(quán)后的線性回歸方程

各線性樣本T3和FT3重復(fù)檢測(cè)結(jié)果、、s及權(quán)重見表1、表2，加權(quán)后的線性回歸方程分別為Y=12.33X+0.45和Y=38.09X+1.33。

表1 T3重復(fù)檢測(cè)結(jié)果及各線性樣本權(quán)重

表2 FT3重復(fù)檢測(cè)結(jié)果及各線性樣本權(quán)重

2.2 T3和FT3各線性樣本線性偏差的95%CI與ADL

根據(jù)線性回歸方程分別計(jì)算T3和FT3各線性樣本的預(yù)期值、線性偏差、線性偏差的95%CI、ADL，結(jié)果見表3、表4。

表3 T3線性偏差CI與ADL

表4 FT3線性偏差CI與ADL

2.3 T3和FT3線性區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

以預(yù)期濃度為X軸，線性偏差為Y軸，將線性偏差、線性偏差的95%CI、ADL作散點(diǎn)圖，其中T3第1～6號(hào)樣本線性偏差的95%CI在ADL范圍內(nèi)，第7號(hào)樣本線性偏差在ADL范圍內(nèi)，F(xiàn)T3第2～4號(hào)樣本線性偏差的95%CI在ADL范圍內(nèi)，第1、5號(hào)樣本線性偏差在ADL范圍內(nèi)，第6號(hào)樣本線性偏差未在ADL范圍內(nèi)，但線性偏差的95%CI與ADL范圍有重疊，第7號(hào)樣本線性偏差的95%CI不在ADL范圍內(nèi)。依據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)（當(dāng)所有樣本線性偏差的95%CI與ADL相交時(shí)，整個(gè)區(qū)間的的線性是可接受的），T3的線性區(qū)間通過(guò)驗(yàn)證，而FT3的線性驗(yàn)證未通過(guò)。見圖1、圖2。

圖1 T3項(xiàng)目線性樣本的線性偏差、線性偏差的95%CI和ADL

圖2 FT3項(xiàng)目線性樣本的線性偏差、線性偏差的95%CI和ADL

3 討論

線性作為定量測(cè)量的程序和分析方法重要的性能指標(biāo)，其評(píng)價(jià)方案在臨床應(yīng)用中不斷發(fā)展[10-11]，與CLSI EP06-A文件中多項(xiàng)式回歸方法相比，CLSI EP06-Ed2文件采用了一種更簡(jiǎn)單、直觀的方法：重復(fù)測(cè)量5個(gè)或6個(gè)濃度跨越線性區(qū)間要求的樣本，然后將測(cè)量結(jié)果與通過(guò)加權(quán)回歸分析的樣本的預(yù)期值進(jìn)行比較，根據(jù)ADL評(píng)估線性偏差，用95%CI檢查并驗(yàn)證線性區(qū)間的一致性。

EP06-Ed2文件在線性驗(yàn)證樣本濃度區(qū)間選擇方面有較強(qiáng)的指導(dǎo)性。由于儀器軟件的限制，一般對(duì)超過(guò)測(cè)量區(qū)間上限（upper limit of quantitation，ULoQ）和/或測(cè)量區(qū)間下限（lower limit of quantitation，LLoQ）的樣本，實(shí)驗(yàn)室可能無(wú)法獲得樣本中待測(cè)物真實(shí)的濃度；同時(shí)，由于測(cè)量程序固有的不精密度，實(shí)驗(yàn)室可能無(wú)法對(duì)非常接近但不超過(guò)LLoQ或ULoQ，特別是LLoQ的樣本，得出一致的結(jié)果。所以在選擇線性驗(yàn)證樣本的濃度區(qū)間時(shí)，可略窄于由LLoQ和ULoQ組成的分析測(cè)量區(qū)間。除了高、低濃度樣本外，還需要3個(gè)（或更多）中間濃度樣本，可通過(guò)高、低濃度樣本按比例制備。線性區(qū)間評(píng)價(jià)所需的重復(fù)測(cè)量次數(shù)由測(cè)量程序的重復(fù)性和ADL確定，一般驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)應(yīng)至少對(duì)每個(gè)樣本在1個(gè)批次內(nèi)重復(fù)檢測(cè)2次。為確保2次單獨(dú)測(cè)量在95%的概率內(nèi)返回?cái)?shù)值結(jié)果，即測(cè)量的結(jié)果不會(huì)有“＞ULoQ”或“＜LLoQ”，對(duì)于重復(fù)性[變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）]為5%～10%的測(cè)量程序，高值樣本濃度可比ULoQ低15%，對(duì)LLoQ處重復(fù)性（CV）為20%的測(cè)量程序，低值樣本濃度可比LLoQ高30%～40%。

EP06-Ed2文件數(shù)據(jù)分析的一個(gè)顯著特征是使用WLS線性回歸分析。當(dāng)測(cè)量程序的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差（s）明顯依賴于濃度時(shí)，加權(quán)可防止高濃度樣本對(duì)數(shù)據(jù)的線性擬合產(chǎn)生不成比例的影響。測(cè)量程序在其分析測(cè)量區(qū)間內(nèi)具有相對(duì)恒定的重復(fù)性（CV），但隨著數(shù)值接近于零，CV開始快速升高，最低濃度的樣本CV通常比較大，所以最低濃度樣本的權(quán)重按照1/s計(jì)算。以每個(gè)樣本中高值樣本所占比例（P）作為自變量，測(cè)量結(jié)果作為因變量，進(jìn)行加權(quán)線性回歸，根據(jù)得到的回歸方程計(jì)算每個(gè)樣本的預(yù)期值。與進(jìn)行線性回歸方法類似的是，在我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 420—2013和第4版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中[12-13]，線性驗(yàn)證以稀釋度為自變量，每個(gè)樣本的測(cè)量為因變量做線性回歸，未規(guī)定對(duì)測(cè)量結(jié)果做加權(quán)處理。

在所有線性驗(yàn)證的指南中，數(shù)據(jù)除了統(tǒng)計(jì)學(xué)上的處理外，都要與臨床應(yīng)用相關(guān)聯(lián)，確定ADL是線性驗(yàn)證的關(guān)鍵步驟。線性偏差是系統(tǒng)誤差（偏移）的一部分，所以ADL不應(yīng)大于允許的偏移。根據(jù)測(cè)量程序預(yù)期臨床用途，ADL可以是一個(gè)常數(shù)（固定）值、相對(duì)值或兩者組合中的較大值。在我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中，T3和T4項(xiàng)目可接受范圍均為±25%，澳大利亞皇家病理學(xué)家學(xué)會(huì)質(zhì)量評(píng)估計(jì)劃設(shè)置的T3可接受范圍為±15%或±0.2 nmol/L，F(xiàn)T3的可接受范圍為±20%或±0.7 pmol/L。本研究設(shè)定2個(gè)項(xiàng)目ADL均為±12.5%。

按照WS/T 420—2013[12]中未加權(quán)的線性回歸分析，本研究FT3最低濃度樣本的偏差為0.34 nmol/L和55.42%，按照EP06-A的多項(xiàng)式回歸分析，T3判斷為線性。由于甲狀腺素結(jié)合球蛋白濃度及結(jié)合力改變，稀釋會(huì)造成FT3結(jié)果不按比例變化，干擾數(shù)據(jù)的判斷，F(xiàn)T3判斷為非線性，其最適擬合為三項(xiàng)式，其最低濃度樣本偏差為-0.56 pmol/L和-47.5%，均超出本研究設(shè)定的ADL，判定為驗(yàn)證不通過(guò)。但如果設(shè)定ADL為±0.7 pmol/L和±12.5%，F(xiàn)T3則為可接受的非線性。

計(jì)算線性偏差的95%CI，采用95%CI檢查并驗(yàn)證的線性區(qū)間的一致性。當(dāng)所有樣本線性偏差的95%CI與ADL相交時(shí)，整個(gè)區(qū)間的線性是可接受的，即線性區(qū)間得到驗(yàn)證。在解釋線性驗(yàn)證結(jié)果時(shí)，應(yīng)考慮以下因素[1]：（1）如果線性偏差的95%CI與ADL重疊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能否定線性聲明；（2）當(dāng)整體性能特征足以滿足臨床需要時(shí)，實(shí)驗(yàn)室有理由接受線性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；（3）當(dāng)整體性能特征不足以滿足臨床需要時(shí)（即超過(guò)TEa），不應(yīng)接受實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查。當(dāng)懷疑存在技術(shù)錯(cuò)誤或其他可識(shí)別的原因時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采取相關(guān)的切實(shí)可行的措施（如重新校準(zhǔn)、常規(guī)維護(hù)程序）來(lái)消除驗(yàn)證失敗的任何可能原因，通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)加以確認(rèn)。

本研究中T3項(xiàng)目所有樣本線性偏差均在ADL范圍內(nèi)，線性區(qū)間得到驗(yàn)證；FT3項(xiàng)目有1個(gè)點(diǎn)線性偏差的95%CI不在ADL范圍內(nèi)，依據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)T3線性驗(yàn)證未通過(guò)，這與依據(jù)CLSI EP06-A文件得出的結(jié)論一致。分析FT3項(xiàng)目未通過(guò)驗(yàn)證的原因，除樣本稀釋可能造成的影響外，還包括選擇的最低濃度樣本略低于LLoQ、重復(fù)性造成的影響、ADL的選擇（特別是低濃度ADL）以及單一使用相對(duì)值的影響。

綜上所述，CLSI EP06-Ed2文件相對(duì)于CLSI EP06-A等文件，對(duì)線性樣本濃度選擇的要求更明確、更合理，數(shù)據(jù)分析處理更有效和簡(jiǎn)便，是非常實(shí)用的定量測(cè)量程序線性驗(yàn)證指南。