FRA-2 mRNA 表達(dá)及DNA 甲基化水平與代謝綜合征的相關(guān)性研究

杜晴晴，侯澤鑫，李 軍，胡 穎，曹國磊，李思源

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子 832002；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，石河子 832002；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院神志科，烏魯木齊 830099；4.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科，烏魯木齊 830011

近年來，西方生活方式在全球范圍內(nèi)日益流行，代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）的患病率也隨之上升，其在一些發(fā)展中國家城市人口中的患病率往往高于發(fā)達(dá)國家，已成為一個(gè)全球性的威脅健康的重要問題。MS 是肥胖或超重、高血糖、胰島素抵抗等多種代謝異常構(gòu)成的復(fù)雜的代謝異常癥候群。MS促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、卒中及惡性腫瘤等疾病的發(fā)生，這些疾病造成的醫(yī)療保健成本和潛在的經(jīng)濟(jì)活動(dòng)損失成本，數(shù)以萬億計(jì)［1-2］。

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式。有研究［3］發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化可能通過在啟動(dòng)子區(qū)域的CpG 序列添加甲基來發(fā)揮作用，參與哺乳動(dòng)物發(fā)育、代謝、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及肥胖和多種疾病的發(fā)生。DNA甲基化也可能與MS的發(fā)生有關(guān)［4］。Fos相關(guān)抗原-2（Fosrelated antigen-2，F(xiàn)RA-2）屬于轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）家族，存在于動(dòng)物的多種組織和細(xì)胞，參與細(xì)胞增殖、分化等過程；FRA-2的異常表達(dá)可導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展［5］。FRA-2參與哺乳動(dòng)物能量平衡、糖脂代謝及胰島素抵抗的調(diào)節(jié)，與MS、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生有關(guān)［6-9］。到目前為止，F(xiàn)RA-2mRNA及DNA甲基化水平與MS的相關(guān)關(guān)系尚不清楚。本研究擬探討FRA-2mRNA及DNA甲基化水平與MS的關(guān)系，探究MS發(fā)生的分子機(jī)制以尋找MS防治的潛在靶點(diǎn)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2020年6月—2021年6月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科就診的患者，根據(jù)《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［10］對MS 的定義，將有MS 危險(xiǎn)因素（高血糖、高血脂、高血壓、肥胖）≥3 項(xiàng)的患者納入MS 組（n=80），有MS 危險(xiǎn)因素1～2 項(xiàng)的患者納入非MS 組（n=80）。MS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)滿足以下≥3 項(xiàng)：①腰圍（waist circumference，WC）女性≥85 cm，男性≥90 cm。②確診高血壓，或收縮壓（systolic blood pressure，SBP） ≥130 mmHg或舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）≥85 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。③高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）＜1.04 mmol/L。④三酰甘油（triacylglycerol，TAG） ≥1.7 mmol/L。⑤確診2 型糖尿病或空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）≥6.1 mmol/L。另外選取同期的健康體檢者納入對照組（無MS 危險(xiǎn)因素，n=80）。各組排除具有以下情況人群：①各種嚴(yán)重肝、腎、心血管疾病者。②長期服用激素、免疫抑制劑者。③近期有外傷或手術(shù)者。④妊娠及哺乳期者。收集患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMⅠ）等資料。本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審查號(hào)：KJ2020-142-01），所有參與的患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集及生化檢測 所有研究對象均禁食12～14 h，晨起空腹抽取靜脈血2 管，每管約2 mL。一管為EDTA 抗凝管，備以后續(xù)DNA 及RNA 提??；另一管為真空采血管，經(jīng)過混勻后9 000×g離心10 min，離心管收集上清液備用，然后均置于-80 ℃冰箱中凍存。使用全自動(dòng)生化分析儀（AU5800，美國貝克曼公司）測定FPG、TAG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）、HDL-C，使用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（COBAS e 601，德國羅氏） 測定空腹胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)ⅠNS）。使用穩(wěn)態(tài)模型評估法來計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-ⅠR），公式為HOMA-ⅠR=FⅠNS×FPG/22.5。

1.2.2 RT-PCR 方法檢測FRA-2mRNA 表達(dá) TRⅠzol法提取RNA，后按照cDNA 第一鏈合成試劑盒（美國APExBⅠO 公司） 說明書合成cDNA 模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃4 min，72 ℃2 min，然后94℃20 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。加入1 對內(nèi)參（β-actin）的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA（引物序列見表1）。使用GelDoc EZ 全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（美國UVB公司）和2-ΔΔCT法分析FRA-2mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.3 MALDⅠ-TOF-MS法檢測FRA-2DNA 甲基化水平 取200 μL血液樣本，提取DNA，使用NanoDrop分光光度儀定量檢測基因組DNA 的濃度及純度，以保證其DNA 濃度＞50 ng/μL，純度［D（260 nm）/D（280 nm）］位于1.7～2.0 之間。依據(jù)EZ DNA 甲基化修飾處理試劑盒（D5001，美國Sequenom 公司）以及美國Sequenom 公司推薦的方式對基因組DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，反應(yīng)條件為：95 ℃30 s，50 ℃15 min，進(jìn)行20 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增DNA，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)熱4 min，72 ℃退火3 min，接下來45個(gè)循環(huán)（94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min）。PCR產(chǎn)物在384-pad光譜芯片（美國Sequenom公司）上測定。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

使用MassARRAY 質(zhì)譜儀（美國SEQUENOM公司）收集質(zhì)譜圖，使用EpiTYPER v1.0.5 軟件生成各CpG 單元的甲基化數(shù)據(jù)。經(jīng)由對比甲基化峰與非甲基化峰的強(qiáng)度來計(jì)算所檢測基因各CpG 單元相對的甲基化率。共檢測了10 個(gè)CpG 單元，分別為CpG 1、CpG 3、CpG 4.5、CpG 6.7、CpG 8、CpG 9.10、CpG 11、CpG 12.13.14、CpG 15.16.17、CpG 19。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以±s表示，方差分析示3 組間年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余資料采用協(xié)方差分析以校正年齡對組間臨床指標(biāo)的影響；非正態(tài)分布定量資料以M（Q1，Q3）表示，采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；每增加1個(gè)危險(xiǎn)因素，F(xiàn)RA-2DNA甲基化水平變化量采用線性回歸分析；指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系采用Spearman 相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間一般資料比較

Kruskal-WallisH檢驗(yàn)顯示，MS 組年齡高于對照組及非MS 組（P＜0.05）。使用協(xié)方差分析校正年齡對組間臨床指標(biāo)的影響后，發(fā)現(xiàn)MS 組BMⅠ、WC、DBP、SBP、FPG、TAG、TC、LDL-C、HOMA-ⅠR均高于對照組及非MS 組（P＜0.05），HDL-C 低于對照組及非MS組（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 3組間一般及臨床資料比較Tab 2 Comparison of general and clinical data among the three groups

2.2 組間FRA-2 mRNA表達(dá)水平比較

與對照組及非MS 組相比，MS 組FRA-2mRNA表達(dá)水平降低（均P=0.000）（圖1）。

圖1 3組間FRA-2 mRNA相對表達(dá)水平比較Fig 1 Comparison of relative expression levels of FRA-2 mRNA among the three groups

2.3 組間FRA-2 DNA甲基化水平比較

協(xié)方差分析結(jié)果（表3、圖2）顯示：與對照組相比，非MS 組及MS 組CpG 1（P=0.014，P=0.016）、CpG 3 （P=0.006，P=0.000）、CpG 12.13.14 （均P=0.000）、CpG 19（均P=0.000）甲基化水平上升；與非MS 組相比，MS 組CpG 4.5、CpG 6.7、CpG 8、CpG 9.10、CpG 15.16.17甲基化水平上升（均P=0.000）。

圖2 FRA-2 DNA甲基化水平聚類分層Fig 2 FRA-2 DNA methylation level clustering stratification

表3 各CpG單元DNA甲基化水平比較Tab 3 Comparison of DNA methylation levels in each CpG unit

2.4 FRA-2 DNA 甲基化水平與MS 危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)的關(guān)系

以FRA-2DNA 甲基化水平（10 個(gè)CpG 單元的平均甲基化率）為因變量，以MS 的危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)為自變量進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果（圖3）顯示，MS 危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)與FRA-2DNA 甲基化水平呈正相關(guān)（β=0.012，P=0.000），即危險(xiǎn)因素每增加1 個(gè)，F(xiàn)RA-2DNA甲基化水平上升0.012%。

圖3 FRA-2 DNA甲基化水平與MS危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)的關(guān)系Fig 3 Relationship between FRA-2 DNA methylation level and the number of MS risk factors

2.5 FRA-2 DNA 甲基化水平與MS 危險(xiǎn)因素的相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)分析結(jié)果（表4）顯示，CpG 3、CpG 4.5、 CpG 6.7、 CpG 8、 CpG 9.10、 CpG 12.13.14、CpG 19 甲基化水平均與WC、SBP、DBP、FPG、TAG 呈正相關(guān)；CpG 1 和CpG 15.16.17 甲基化水平與WC、DBP、TAG 呈正相關(guān)；CpG 1、CpG 3、CpG 4.5、CpG 8、CpG 9.10、CpG 12.13.14、CpG 19甲基化水平與HDL-C呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）。

表4 FRA-2 DNA甲基化水平與MS危險(xiǎn)因素的相關(guān)性分析Tab 4 Correlation analysis between FRA-2 DNA methylation level and MS risk factors

2.6 FRA-2 DNA甲基化水平與mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析的結(jié)果（圖4）所示，F(xiàn)RA-2DNA甲基化水平（10個(gè)CpG單元的平均甲基化率）與FRA-2mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.607，P=0.000）。

圖4 FRA-2 DNA甲基化水平與mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性Fig 4 Correlation between FRA-2 DNA methylation level and mRNA expression level

3 討論

DNA 甲基化是一種重要的修飾方式，可以調(diào)控基因表達(dá)，在不改變分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的前提下發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，其與高血糖、高血壓等心血管疾病的危險(xiǎn)因素增多有關(guān)［11］。既往研究［12］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RA-2蛋白參與了糖脂代謝紊亂及MS 的發(fā)生。目前關(guān)于FRA-2mRNA及DNA甲基化表達(dá)水平與MS相關(guān)性的報(bào)道較少。

趙天明等［13］通過流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，隨年齡的增加MS 的患病率上升。本研究結(jié)果顯示，與對照組及非MS 組相比，MS 組年齡更高；可能是由于隨著年齡增加，機(jī)體器官功能有所減退，MS 危險(xiǎn)因素的成分增加，患病概率增大。CHⅠURAZZⅠ等［14］研究顯示，MS 人群表現(xiàn)為中心性肥胖、高血壓、高血糖、高血脂及胰島素抵抗的特征，與對照組及非MS組比較，MS 組WC、DBP、SBP、FPG、TAG、TC、LDL-C、HOMA-ⅠR 上升，HDL-C 降低；我們的研究數(shù)據(jù)與該研究相似。

通過RT-PCR 對研究對象FRA-2mRNA 進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，MS 組FRA-2mRNA 表達(dá)水平顯著低于對照組及非MS 組，提示MS 的發(fā)生發(fā)展可能與FRA-2mRNA 表達(dá)下調(diào)有關(guān)。SAMBLAS 等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，甲基化參與肥胖人群代謝及循環(huán)紊亂，缺氧誘導(dǎo)因子3A（hypoxia inducible factor 3A，HIF3A）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3 （insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1 （sterol regulatory element binding factor 1，SREBF1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、 晝夜節(jié)律鐘（clock circadian regulator，CLOCK）等基因的甲基化水平可作為預(yù)測和評估MS的重要標(biāo)志。我們進(jìn)一步用MALDⅠ-TOF-MS 對外周血中FRA-2DNA甲基化水平進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，與對照組相比，MS 組多個(gè)CpG 單元甲基化水平上升，可以推測在MS發(fā)生中，F(xiàn)RA-2DNA 高甲基化可能起到重要作用。相關(guān)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)RA-2基因9 個(gè)CpG 單元甲基化水平與WC、DBP、TAG 呈正相關(guān)，7 個(gè)CpG 單元甲基化水平與SBP 及FPG 呈正相關(guān)，7 個(gè)CpG 單元甲基化水平與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)；推測FRA-2可能通過DNA 高甲基化的形式參與血糖、血脂、血壓等的調(diào)節(jié)，進(jìn)而參與MS 發(fā)生發(fā)展的過程。既往研究［15］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RA-2與糖尿病患者的FPG、TG的調(diào)節(jié)有關(guān)；本研究結(jié)果與之相似。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RA-2DNA高甲基水平與MS 人群SBP 及DBP 升高之間存在相關(guān)性；該結(jié)果與以往研究［12］不同，可能與納入研究對象危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)的差異性或不同的遺傳背景有關(guān)。近年來，有研究［16-17］報(bào)道，DNA甲基化可通過影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）參與高血壓的發(fā)生，但FRA-2是否經(jīng)該通路發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。全貞玉等［18］認(rèn)為，MS的發(fā)生及嚴(yán)重程度與危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)有關(guān)。本研究通過線性分析發(fā)現(xiàn)，危險(xiǎn)因素每增加1個(gè)，F(xiàn)RA-2DNA甲基化水平上升0.012%，提示MS 患者FRA-2基因甲基化程度可能受危險(xiǎn)因素個(gè)數(shù)的影響。XⅠE 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中，DNA 甲基化水平對mRNA 表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，DNA可通過高甲基化的方式下調(diào)mRNA的表達(dá)，從而參與疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)FRA-2DNA甲基化水平與mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示FRA-2基因在MS 中可能具有相似的致病機(jī)制，但其具體的分子機(jī)制及信號(hào)通路，還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FRA-2基因甲基化水平與MS發(fā)生具有一定的相關(guān)性，DNA 甲基化水平增高從而下調(diào)mRNA 表達(dá)可能在MS 發(fā)生中發(fā)揮作用。未來需要設(shè)計(jì)更大樣本量的多中心研究及前瞻性研究，以明確FRA-2與MS 發(fā)生的因果關(guān)系及FRA-2參與MS發(fā)生的機(jī)制。