四味護(hù)肝飲對D-半乳糖胺致小鼠肝損傷的預(yù)防作用及相關(guān)機(jī)制

張一凡， 李怡萍， 劉洋， 周岐鳴， 唐志鵬，2， 宋海燕，2*

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬龍華醫(yī)院 脾胃病研究所， 上海 200032； 2. 中加聯(lián)合脾胃病研究中心， 上海 200032)

肝損傷是各種肝臟疾病的病變結(jié)果，肝臟長期損害，會出現(xiàn)炎癥、纖維化、細(xì)胞彌漫性壞死和變性，肝臟腫脹、滲出和充血，如果沒有及時(shí)治療，可造成肝硬化、肝衰竭、甚至肝癌等終末期肝臟病[1-2]。我國每年有近 28 萬人死于肝硬化、肝癌等肝臟相關(guān)的疾病，給社會帶來極大負(fù)擔(dān)[3]。

近年來研究表明，中醫(yī)藥具有療效明確、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，單獨(dú)或聯(lián)合西藥使用保肝效果顯著[4-5]。根據(jù)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院長期治療肝損傷用藥經(jīng)驗(yàn)及中醫(yī)藥理論，課題組采用常用保肝抗炎核心藥物組方為四味護(hù)肝飲，方劑組成包括：垂盆草、茯苓、陳皮、甘草，具有清熱解毒、舒肝理氣健脾之功效。本研究應(yīng)用D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，四味護(hù)肝飲干預(yù)，觀察該復(fù)方防治肝損傷的作用，并基于A20調(diào)控炎癥通路來探討其藥物作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

5周齡的雄性C57BL/6J小鼠24只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號碼：SCXK(滬)2012-0002，飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房，溫度為(24±2)℃，濕度為(55%±10%)，光照時(shí)間12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批號:LHERAW-190019。四味護(hù)肝飲由垂盆草15 g、茯苓12 g、陳皮6 g、甘草3 g等4味中藥組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院制劑室代加工。基礎(chǔ)飼料購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。美能(復(fù)方甘草酸苷片)，購自日本米諾發(fā)源制藥株式會社。引物購于上海閃晶分子生物科技有限公司。β-actin抗體購于杭州華安生物技術(shù)有限公司，抗小鼠A20、p-NF-κB、TNF-α、IL-1β抗體購于CST公司。高速冷凍離心機(jī)(5810R)購自德國 Eppendorf 公司；StepOne Plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500)購自美國 ABI 公司；酶標(biāo)儀(SynergyH4)購自美國 BioTek 公司；全自動(dòng)生化儀(cobas8000)購自瑞士ROCHE公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物造模與藥物干預(yù)

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字表法，完全隨機(jī)分為正常組(CON)、模型組(MOD)、四味護(hù)肝飲組(SHD)和作為陽性藥物對照的美能組(CG)，每組各6只。均給予正常基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，藥物使用劑量按照臨床成人使用劑量進(jìn)行人鼠等效換算。SHD組每天予以相應(yīng)藥物(10.2 g·kg-1)灌胃，CG組每天予以美能(0.35 g·kg-1)灌胃，CON組與MOD組予相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，持續(xù)10 d。在末次給藥1 h后，除CON組外，其余各組分別予以腹腔注射800 mg·kg-1的D-Gal N溶液以誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。肝損傷造模方法參考Xu等[5]的研究，在注射D-Gal N溶液24 h后，處理小鼠收取血清及肝組織備用。通過觀察小鼠肝組織病理變化、血清肝功能指標(biāo)及炎癥因子表達(dá)水平，檢測造模及藥物干預(yù)效果。

1.2.2 血清生化檢測小鼠肝酶水平

血清送上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗(yàn)科，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，AST)、血清膽紅素(total bilirubin，TBIL)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，所需相關(guān)試劑采購于Roche公司。

1.2.3 HE染色檢測小鼠肝組織病理變化

將小鼠肝組織在4%中性甲醛溶液中固定至少24 h，脫水浸蠟后，組織進(jìn)行石蠟包埋。包埋組織切片，厚度約4 μm，按照HE標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行染色封片晾干后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 RT-PCR 檢測小鼠肝組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平

基因序列通過Blast網(wǎng)上驗(yàn)證，引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，引物序列見表1。①總RNA的提取：按照Trizol法提取RNA。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：選用ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，在RNase-free 0.2 mL EP管中配制逆轉(zhuǎn)錄混合液，反應(yīng)體系共20 μL。③PCR擴(kuò)增：在StepOnePlusTMRT-PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。采用2-ΔΔCT法分析結(jié)果，計(jì)算目的基因在各組的相對表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.5 Western Blot 檢測小鼠肝組織炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取100 mg肝組織，加入1 mL細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品加入上樣緩沖液， 95 ℃孵育 5 min 進(jìn)行蛋白變性，上樣至聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜。封閉1 h 后，分別以一抗(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶500)4 ℃孵育過夜，二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶2 000)室溫孵育 1 h。電化學(xué)法顯影后，采集條帶并進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四味護(hù)肝飲對小鼠肝組織病理改變的影響

CON組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常且清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)無變性、壞死；MOD組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞漿疏松，肝細(xì)胞中可見嗜酸性小體形成，并有小灶性壞死以及浸潤性炎癥細(xì)胞。與MOD組對比，SHD和CG組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常，炎癥細(xì)胞減少(圖1)。

圖1 小鼠肝臟組織HE染色Figure 1 HE staining of mouse liver tissue

2.2 四味護(hù)肝飲對小鼠肝功能的影響

MOD組小鼠血清ALT、AST、LDH較CON組顯著升高(P<0.05)， TBIL有升高趨勢。與MOD組比較，SHD組小鼠血清ALT、AST、LDH顯著降低(P<0.01)，TBIL有下降趨勢；CG組小鼠血清ALT、AST、LDH顯著降低(P<0.01)，TBIL有下降趨勢(圖2)。

A：小鼠血清ALT水平；B：小鼠血清AST水平；C：小鼠LDH水平；D：小鼠血清TBIL水平。1)與CON組比較，P<0.05；2)與MOD組比較，P<0.05A：The level of mice serum ALT；B：The level of mice serum AST；C：The level of mice serum LDH；D：The level of mice serum TBIL. 1) Compared with CON group, P<0.05; 2) Compared with MOD group, P<0.05圖2 小鼠血清ALT、AST、LDH和TBIL水平Figure 2 The levels of mice serum ALT, AST, LDH and TBIL

2.3 四味護(hù)肝飲對脂質(zhì)過氧化物HNE表達(dá)的影響

與CON組比較，D-半乳糖胺誘導(dǎo)的MOD組小鼠肝組織4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal，HNE)蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與MOD組比較，SHD組和CG組的HNE蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)(圖3)。

1)與CON組比較，P<0.05；2)與MOD組比較，P<0.051) Compared with CON group, P<0.05; 2) Compared with MOD group, P<0.05圖3 小鼠肝組織HNE蛋白表達(dá)水平Figure 3 HNE protein expression level of mice liver tissue

A： 小鼠肝組織TNF-α mRNA表達(dá)水平;B： 小鼠肝組織IL-1β mRNA表達(dá)水平;C：小鼠肝組織炎癥蛋白印跡圖;D： 小鼠肝組織炎癥蛋白相對表達(dá)水平示意圖，以β-actin 作為上樣量對照。1) 與CON組比較，P<0.05；2) 與MOD組比較，P<0.05A： mRNA expression level of TNF-α in mice liver tissue;B： mRNA expression level of IL-1β in mice liver tissue; C：Western blotting diagram of inflammatory proteins in mice liver tissue; D： Schematic diagram of inflammatory protein relative expression, using β-actin as the loading control. 1) Compared with CON group, P<0.05; 2) Compared with MOD group, P<0.05圖4 小鼠肝組織IL-1β、TNF-α mRNA、蛋白表達(dá)水平Figure 4 IL-1β and TNF-α mRNA, protein expression levels of mice liver tissue

2.4 四味護(hù)肝飲對小鼠肝臟炎癥的影響

與CON組比較，MOD組急性肝損傷小鼠IL-1β、TNF-α mRNA、蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。與MOD組比較，SHD組TNF-αmRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),IL-1βmRNA表達(dá)有下調(diào)的趨勢，IL-1β、TNF-α蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)；CG組IL-1β、TNF-α mRNA、蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.5 四味護(hù)肝飲調(diào)控A20抑制NF-κB活化

與CON組比較，D-半乳糖胺誘導(dǎo)的MOD組小鼠肝組織鋅指蛋白A20(zinc-finger protein A20,A20)有升高趨勢，p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與MOD組比較，SHD組和CG組A20蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)、p-NF-κB蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)。(見圖5)

1)與CON組比較，P<0.05；2)與MOD組比較，P<0.051) Compared with CON group, P<0.05; 2) Compared with MOD group, P<0.05.圖5 小鼠肝組織A20、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平Figure 5 A20 and p-NF-κB protein expression levels of mouse liver tissue

3 結(jié)果

近年來中醫(yī)藥在改善病毒性肝炎、肝損傷中顯示出較顯著的作用[6-7]。本課題組根據(jù)中醫(yī)理論及臨床經(jīng)驗(yàn)，自擬中藥復(fù)方四味護(hù)肝飲，其由垂盆草、茯苓、陳皮、甘草組成?，F(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究顯示，方中4味藥均有降酶保肝抗感染的作用。垂盆草的水溶性總苷有較好的免疫調(diào)節(jié)及降酶保肝作用，生物堿類成分也有保肝作用；垂盆草提取物通過調(diào)節(jié)miR-124抑制Hedgehog信號通路，減輕D-Gal N、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)的急性肝損傷[8]；通過活化核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子-2 (nuclear factor erythroid -related factor 2，Nrf2)及抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號通路，發(fā)揮保肝作用[9]。茯苓主要成分三萜類化合物(茯苓酸、茯苓素)具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎癥等活性，能夠顯著降低小鼠血清中 AST、ALT活性，改善肝組織纖維化[10]。陳皮中的黃酮類成分具有顯著的肝保護(hù)作用[11]。甘草的主要活性成分為三萜皂苷類，具有較強(qiáng)的抗病毒、保護(hù)肝細(xì)胞、降低ALT、AST以及TBIL水平的作用[12]。

D-Gal N是一種肝臟特異性毒素，其腹腔注射誘導(dǎo)肝損傷是一種成熟的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停c病毒性肝炎的肝損傷病理機(jī)制相近。D-Gal N一方面干擾肝細(xì)胞尿嘧啶核苷酸代謝，另一方面通過產(chǎn)生自由基引起脂質(zhì)過氧化，均導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞內(nèi)Ca2+蓄積，通過NF-κB和 p38 MAPK等信號通路，引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞壞死等過程[13-14]。其中，HNE被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最終產(chǎn)物之一, 參與調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子，如Nrf2、NF-κB和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome-proliferator-activated receptors，PPAR)[15]。本研究用D-Gal N腹腔注射導(dǎo)致小鼠肝組織出現(xiàn)炎癥病灶，血清ALT、AST、LDH顯著升高，肝組織脂質(zhì)過氧化物HNE蛋白表達(dá)顯著升高，炎癥因子IL-1β、TNF-α mRNA、蛋白在肝臟中表達(dá)明顯增加，發(fā)生急性肝損傷。而提前給予四味護(hù)肝飲和美能的小鼠上述指標(biāo)均有改善，血清肝功能指標(biāo)下調(diào)，肝臟無明顯炎性細(xì)胞浸潤，HNE蛋白表達(dá)下調(diào)，炎癥因子表達(dá)下調(diào)，表明四味護(hù)肝飲可減輕急性肝損傷小鼠的肝臟炎癥。

NF-κB的活化是調(diào)控炎癥因子表達(dá)的關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，而A20是細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制中的一類炎癥調(diào)節(jié)性蛋白，是NF-κB信號系統(tǒng)中的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，可減少TNF-α、IL-1β等炎性因子的產(chǎn)生[16]。Boone等[17]研究發(fā)現(xiàn)A20缺失的小鼠會發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，且無法阻斷經(jīng)LPS、TNF-α等外源性誘導(dǎo)激活的NF-κB信號通路。Catrysse等[18]研究證實(shí)，肝細(xì)胞A20基因特異性敲除小鼠會自發(fā)出現(xiàn)慢性肝臟炎癥，表明A20是肝臟保護(hù)因子。本研究結(jié)果顯示，急性肝損傷小鼠A20蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢，p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高；與MOD組比較，四味護(hù)肝飲顯著上調(diào)A20 mRNA和蛋白表達(dá)、下調(diào)p-NF-κB蛋白表達(dá)，從而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，表明四味護(hù)肝飲可能通過調(diào)控A20/NF-κB抑制肝損傷炎癥。

綜上，本研究表明四味護(hù)肝飲可改善小鼠急性肝損傷、減輕炎癥反應(yīng)，通過上調(diào)A20表達(dá)抑制NF-κB的活化減少炎癥因子表達(dá)可能是其發(fā)揮藥效作用的部分機(jī)制。研究結(jié)果為四味護(hù)肝飲的臨床應(yīng)用提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其藥效及更廣泛的機(jī)制研究將進(jìn)一步通過后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來證實(shí)和探討。

作者貢獻(xiàn)聲明

張一凡：完成實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；李怡萍：完成實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；劉洋：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；周岐鳴：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；唐志鵬：提出研究思路和框架；宋海燕：提出研究思路和框架，修改論文

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。