基于微生物學(xué)的速食食品致病菌檢驗研究

王輝　張亮　周美靜

摘 要：分析基于微生物學(xué)的速食食品致病菌檢驗檢測結(jié)果，總結(jié)相應(yīng)的檢驗方法。采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法和實時熒光定量PCR 法進行檢驗。對兩種檢驗方法下的致病菌陽性檢出情況進行統(tǒng)計，計算出總陽性率。并對兩組檢驗所耗費的時間進行記錄，計算出平均用時結(jié)果。經(jīng)統(tǒng)計與組間比較，實時熒光定量PCR 法的樣本陽性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高，P<0.05。對比不同檢驗方法下的用時情況，可得實時熒光定量PCR 法的平均用時為（2.35±0.12）h，明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的（37.35±0.15）h，P<0.05?；谖⑸飳W(xué)的速食食品致病菌檢驗檢過程中應(yīng)用不同的檢驗方法均能獲得一定的檢驗結(jié)果，其中實時熒光定量PCR 法的檢驗效果更為理想。

關(guān)鍵詞：速食食品;致病菌;檢驗;實時熒光定量PCR 法;傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法

中圖分類號：TS207 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-5922（2022）04-0084-04

Abstract：? To analyze the test results of pathogenic bacteria in fast-food food based on microbiology and summarize the corresponding test methods. Traditional bacterial isolation and culture method and real-time fluorescent quantitative PCR method were used for detection. Count the positive detection of pathogenic bacteria under the two test methods， and calculate the total positive rate. Meanwhile， record the time spent in the two sets of tests， and calculate the average time. According to statistics and comparison between groups， the positive detection rate of real-time fluorescent quantitative PCR method was 11.00%， which was significantly higher than the 8.00% of traditional bacterial isolation and culture method， and P<0.05. Comparing the time under different test methods， the average time of real-time fluorescent quantitative PCR method is （2.35±0.12）h， which is significantly shorter than the （37.35±0.15）h of traditional bacterial isolation and culture method， and P<0.05. In the process of microbiology-based fast food pathogenic bacteria detection， the application of different inspection methods can obtain certain inspection results， and the detection effect of real-time fluorescent quantitative PCR method is more ideal.

Key words：? fast food;pathogenic bacteria;inspection;real-time fluorescent quantitative PCR method;traditional bacterial isolation and culture method

目前，食品安全因為與人們的生活和健康息息相關(guān)，已經(jīng)成為全社會廣泛關(guān)注的熱點話題[1]。為了確保食品的安全性，還需要做好相應(yīng)的微生物檢驗工作。隨著時代的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，食品的種類也日漸豐富，相應(yīng)地，食品安全問題也更加受到重視。速食食品具有口味繁多、方便快捷等特點，在人們的日常生活中十分常見，帶給大家極大的便利。但是，速食食品也容易受到污染，出現(xiàn)各種致病菌。為此，針對各種速食食品，還需要重視相關(guān)的致病菌檢驗。目前，在檢驗過程中，可以選擇應(yīng)用不同的檢驗方法[2]。在本文的研究中，選擇200份含有食源性致病菌的速食食品樣本進行隨機分組，分別采用傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法和實時熒光定量PCR 法進行檢驗。通過比較不同檢驗方法的效果，得出較為合理的檢驗方案。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源

此次實驗用標(biāo)準(zhǔn)菌株及其來源于編號情況如表1所示。

1.2 試劑和儀器

此次研究中使用的試劑以及儀器種類分別為：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)）;PCR 擴增試劑盒（杭州妙麗生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）;沙門氏菌核酸檢測試劑盒（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）;副溶血弧菌核酸檢測試劑盒（廣州深華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）;金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（上海創(chuàng)坤生物科技有限公司生產(chǎn)）;志賀氏菌核酸檢測試劑盒（上海滬震生物科技有限公司生產(chǎn)）;單核細(xì)胞增生性李斯特菌核酸檢測試劑盒（廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)）;蠟樣芽孢桿菌核酸檢測試劑盒（上海富勒生物科技有限公司生產(chǎn)）;熒光定量PCR 儀（中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)）;臺式高速冷凍離心機（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司生產(chǎn)）。B81FD38A-9D7F-4C4C-B2AE-FFE3109EC21C

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)分離鑒定方法

采用傳統(tǒng)分離鑒定方式進行檢驗，包括：前增菌、選擇性增菌、平板分離、生化篩選、血清學(xué)鑒定。在檢驗過程中，根據(jù)分離培養(yǎng)后不同致病菌的化學(xué)組成情況或者代謝產(chǎn)物類型，結(jié)合其不同的生理生化等特性，開展生化反應(yīng)實驗，動物毒理實驗，溶血實驗，對不同的致病菌予以鑒定。

1.3.2 實時熒光定量PCR 法

（1）菌株基因組DNA 制備

選取不同培養(yǎng)基上的單個菌落，嚴(yán)格依照不同細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進行操作，按照操作流程，將不同菌株的基因組DNA提取出來，提取完畢后，置于-20℃條件下凍存?zhèn)溆?，作用是陽性對照?/p>

（2）樣本前處理與DNA 提取

對200份速食食品樣品進行處理，于無菌條件下，取25.0 g 食品樣品均質(zhì)，將其添加到已經(jīng)經(jīng)過滅菌處理的液體培養(yǎng)基（225 mL）中。之后，置于37℃條件下開展增菌培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，取50 μL 增菌液進行DNA 提取。針對不同菌株的情況，選擇相應(yīng)的核酸檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明進行操作，完成檢測。

（3）實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系及程序

將食品提取的DNA以及不同菌株的DNA 作為模板，利用特異性引物與探針進行PCR 擴增。研究PCR 擴增梯度循環(huán)反應(yīng)相關(guān)循環(huán)數(shù)與反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度如表2所示。

（4）陽性結(jié)果判定

在完成反應(yīng)之后，對結(jié)果進行判定。其中，如果待測樣品檢測所得循環(huán)閾值（cyclethreshold，Ct值）小于等于35，且存在明顯的指數(shù)增長情況，則證明PCR 過程中出現(xiàn)目標(biāo)DNA 的擴增。在空白對照結(jié)果、陽性對照結(jié)果、陰性對照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陽性。如果檢測所得的Ct 值在35～38的范圍之內(nèi)，則需要重新進行PCR 擴增操作。對再次擴增后的外源基因Ct 值進行觀察，如果該數(shù)值仍然大于35，且存在明顯的指數(shù)增長現(xiàn)象，在空白對照結(jié)果、陽性對照結(jié)果、陰性對照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陽性。如果經(jīng)過再次擴增操作后，外源基因的Ct 值高于38，在空白對照結(jié)果、陽性對照結(jié)果、陰性對照結(jié)果均正常的情況下，可將其判定為陰性[3]。

1.4 觀察指標(biāo)

對兩種檢驗方法下的致病菌陽性檢出情況進行統(tǒng)計，相關(guān)的致病菌包括計算出總陽性率。并對兩組檢驗所耗費的時間進行記錄，計算出平均用時結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

對研究過程中采集到的各項數(shù)據(jù)進行匯總，統(tǒng)一導(dǎo)入到統(tǒng)計學(xué)軟件 SPSS 21.0中進行出處理。研究中涉及到的各種計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間的統(tǒng)計學(xué)檢驗采用 t 檢驗，各項計數(shù)資料的表示方法為例，%，組間檢驗采用卡方檢驗。檢驗后實現(xiàn)（P< 0.05），則證明組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢驗方法的陽性檢出率統(tǒng)計比較

經(jīng)統(tǒng)計與組間比較，實時熒光定量PCR 法的樣本陽性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高（P< 0.05），具體統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。

2.2 不同檢驗方法的平均用時統(tǒng)計比較

對比不同檢驗方法下的用時情況，可得實時熒光定量PCR 法的平均用時明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法（P< 0.05），具體統(tǒng)計結(jié)果如表4所示。

3 討論

長期以來，食品安全一直都是備受社會各界關(guān)注的重要課題。食源性疾病是公認(rèn)的、全球首要的食品安全問題，也是首要的公共衛(wèi)生問題。食品微生物檢測的3大指標(biāo)是菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌，食品中常見的致病菌有沙門氏菌，變形桿菌，副溶血性弧菌，致病性大腸桿菌，蠟樣芽孢桿菌，肉毒梭狀芽胞桿菌等。食品中的致病菌、污染物（真菌毒素）對消費者健康危害較大。近年來，各種致病菌污染所引起的食源性疾病時有出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅到公眾的健康，也造成了一定的經(jīng)濟損[4]。確保食品安全的關(guān)鍵，在于采取有效的方法，快速篩查受污染的食物。

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，生產(chǎn)模式、生產(chǎn)規(guī)模甚至消費習(xí)慣均發(fā)生變化，再加上我國特有的飲食文化，目前，各種不同類型、不同口味的速食食品在人們的生活中十分常見，給大家的日常生活提供了極大的便利[5]。但是，速食食品的制作、加工、包裝、運輸、貯藏等過程中極易被各種致病菌所侵染，進而影響到食品的質(zhì)量和安全，并直接威脅到廣大消費者的身體健康，甚至是生命安全。為此，針對各種速食食品，應(yīng)注意從微生物角度出發(fā)，重視對其相關(guān)致病菌的檢驗和分析。在具體的檢驗過程中，可以選擇應(yīng)用不同的檢驗方法。以往在進行檢驗的時候，應(yīng)用的大多是傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法[6]。應(yīng)用這一方法進行檢驗的過程中，需要結(jié)合檢驗需求，對各種致病菌進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，不同微生物所需的生長環(huán)境條件也各不相同，為獲得理想的培養(yǎng)效果，還需要針對不同微生物的特點進行相應(yīng)的培養(yǎng)基選擇和溫度、酸堿度控制等等。例如：腸出血性大腸桿菌0157∶H7可以利用與一般大腸桿菌發(fā)酵山梨醇的特性不同，在SMAC瓊脂上為無色菌落，而一般大腸桿菌為粉紅色菌落來鑒別腸出血性大腸桿菌0157∶H7。整個過程操作十分繁瑣，復(fù)雜，并需要耗費大量的人力、物力。而且，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法下，對于那些不容易被培養(yǎng)出來的致病菌，往往難以進行檢測。另外，檢驗所耗費的時間也較長。

目前食物致病菌的檢查通過增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→確認(rèn)試驗，整個過程需要7～14 d的時間，周期長，操作繁瑣，已不適應(yīng)時代發(fā)展的需要。因此，開發(fā)快速、靈敏的食源性致病菌檢測方法至關(guān)重要。隨著時代的發(fā)展，各種新型的檢驗技術(shù)手段開始被開發(fā)出來，并逐漸應(yīng)用到各種食品的致病菌檢驗之中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種快速、靈敏、高通量的方法，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于多種食源性致病菌的快速檢測之中。熒光定量PCR（Real-Time PCR）技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，對未知模板進行定量分析的方法。具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、操作簡便、特異性和可靠性更強、自動化程度高、無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點。細(xì)菌的PCR檢測流程主要包括核酸提取、擴增和檢測，目前，不同的PCR方法，包括常規(guī)PCR、實時PCR、多重PCR、免疫PCR和微流控PCR等，均有文獻報道應(yīng)用于各種細(xì)菌檢測。B81FD38A-9D7F-4C4C-B2AE-FFE3109EC21C

在本文的研究過程中，選擇應(yīng)用實時熒光定量PCR 技術(shù)。該技術(shù)是一種新型的檢驗技術(shù)，傳統(tǒng)的檢測方法操作繁瑣、準(zhǔn)確度不高，實時熒光定量PCR方法是基于基因的方法，比傳統(tǒng)的檢驗方法更準(zhǔn)確、快速。與傳統(tǒng)定量檢驗不同，傳統(tǒng)的檢驗方法只能進行重點檢驗，而采用全封閉管分析的實時熒光定量PCR 技術(shù)可以借助一定的電腦分析軟件對PCR 擴增產(chǎn)物的實時動態(tài)地進行監(jiān)測和自動定量分析[7]。在檢驗過程中，應(yīng)用該技術(shù)，可以根據(jù)基因序列設(shè)計特異性的引物和熒光探針，從細(xì)胞或特定組織中提取總RNA。之后，使用設(shè)計合成的引物，以一定的樣品為模板，進行Real Time PCR反應(yīng)，確認(rèn)引物模板的反應(yīng)性能，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進行定量分析。在實時熒光定量PCR （qPCR）中，反應(yīng)以循環(huán)中首次檢測到目標(biāo)擴增的時間點為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累積的擴增量。因此，整個檢驗和分析的過程十分方便、快捷、高效，極大地提高了檢測的效率和精密度以及靈敏度。在本文的研究中，選擇應(yīng)用實時熒光定量PCR 技術(shù)對速食食品的致病菌情況進行檢驗。在檢驗過程中，選擇了一些常見的食源性致病菌進行研究，包括蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、志賀氏菌，以及金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等等。在研究中，對所獲得的200份速食食品樣品進行了檢測，檢測中應(yīng)用不同的檢測方法，并對檢測結(jié)果進行了分析。通過分析發(fā)現(xiàn)，在樣本陽性檢出率方面，實時熒光定量PCR 法的樣本陽性檢出率為11.00%，較傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的8.00%明顯較高。這一結(jié)果表明，與傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法相比較，應(yīng)用實時熒光定量PCR 法可以更好地對各種陽性標(biāo)本予以檢出，檢驗的精確度更高。另外，不同檢驗方法在所消耗時間方面也存在一定的差異。此次研究中，對比不同檢驗方法下的用時情況發(fā)現(xiàn)，實時熒光定量PCR 法的平均用時為（2.35±0.12）h，明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法的（37.35±0.15）h。由此可知，實時熒光定量PCR 法是一種高效、方便、快捷的檢驗方法，在提高檢驗效果的同時，也可以有效縮短檢驗所需時間，這對提高實際工作中的致病菌檢驗效率意義重大[8]。但是，在具體的應(yīng)用過程中，實時熒光定量PCR 技術(shù)、也具有一定的缺陷和不足。例如，該方法的檢測的過程中很多因素都可能導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)假陽性結(jié)果，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。出現(xiàn)這一情況主要是因為PCR 方法的靈敏度較高，可能會對已經(jīng)死亡的菌體進行擴增而導(dǎo)致的。另外，該檢驗方式的整體檢測成本較高，在實踐中進行大面積推廣還存在一定的難度。因此，如何快速有效鑒定各種致病菌，還有待于進一步研究和完善。

4 結(jié)語

總之，隨著生活水平的提高，在人們的生活中，對食品的質(zhì)量安全的關(guān)注度也在逐漸增強。食品不僅僅是充當(dāng)著人們營養(yǎng)的主要來源，還是關(guān)系到人們生活、工作、學(xué)習(xí)的重要角色。是消費者和全社會所共同認(rèn)同和關(guān)注的問題之一。所以，對食品的安全監(jiān)測對個人來說可以有效確保生活質(zhì)量的不斷提高。而如果相關(guān)的檢測部門采用科學(xué)有效的方法，對各類食物進行認(rèn)真檢測，就能夠從根本上保證食品衛(wèi)生的安全。通過本文的分析也了解到，傳統(tǒng)的檢測方法耗時較長，準(zhǔn)確性也偏低，無法滿足市場的需求。而應(yīng)用實時熒光定量PCR 技術(shù)則能獲得更為理想的檢驗效果。為此，在今后的食品致病菌檢驗中，可以積極地嘗試對這一方法的推廣應(yīng)用。

【參考文獻】

[1] 李靜，成志平.食品冷鏈物流平臺設(shè)計及包裝材料安全評價[J].粘接，2021，48（10）：151-154.

[2] 張思文，劉思潔，王娟，等.2018年吉林省外賣食品中致病菌監(jiān)測結(jié)果分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（24）：9 349-9 353.

[3] 林碧蓮，柯振華.2017～2019年福建省預(yù)包裝食品中致病菌污染狀況調(diào)查與分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（13）：4 207-4 213.

[4] 趙麗娜，申進玲，寧雪，等.2017～2019年我國進口食品食源性致病菌污染狀況分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（9）：2 930-2 935.

[5] 吳高林，喬昕，戴月.江蘇省《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》跟蹤評價[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（23）：9 057-9 062.

[6] 姚雪婷，趙鵬，蔣玉艷，等.2011-2016年廣西壯族自治區(qū)市售嬰幼兒食品食源性致病菌監(jiān)測結(jié)果分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2020，32（3）：288-293.

[7] 羅月，薛春洪，應(yīng)俊強，等.2010-2019年內(nèi)江市食品中食源性致病菌監(jiān)測情況分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，2021，37（1）：43-47.

[8] 喬敏.基于納米材料的生物傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用研究[J].粘接，2021，47（9）：72-74，164.B81FD38A-9D7F-4C4C-B2AE-FFE3109EC21C