不同劑型的砂生槐總生物堿對多房棘球蚴小鼠的藥效學(xué)作用※

甘雪輝，胡春暉&，都 濤，高瑞雪，高 攀，張發(fā)斌*

(1.青海大學(xué)，青海 西寧 810001；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，四川 成都 610083；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

不同劑型的砂生槐總生物堿(Total alkaloids ofSophoramoocrorftiana，簡稱TA-SM)對多房棘球蚴小鼠的藥效學(xué)作用效果不明確，導(dǎo)致臨床選擇無明確依據(jù)。本研究比較不同劑型的TA-SM對多房棘球蚴小鼠的藥效學(xué)作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

用多房棘球蚴保種的蒙古長爪沙鼠由青海省包蟲病重點實驗室提供。昆明雄性小鼠(Kunming mice，KM小鼠)，體重(20±2)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0008。實驗動物的使用和處理經(jīng)過青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 實驗試劑

Total RNA提取試劑(TaKaRa公司，貨號：9109)；去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，貨號：RR047A)；Takara嵌合法Real Time PCR(qPCR)試劑盒(TaKaRa公司，貨號：RR820A)；10×紅細胞裂解液(聯(lián)科生物，貨號：4006721600)；PE-CF594 CD3e流式抗體(BD公司，貨號：562286)；APC CD4流式抗體(BD公司，貨號：553051)；PE CD8a流式抗體(BD公司，貨號：553032)；FITC CD19流式抗體(BD公司，貨號：557398)；堿性磷酸酶(ALP) 比色法測試盒(Elabscience公司，貨號：E-BC-K091-M)；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT/γ-GT)比色法測試盒(Elabscience公司，貨號：E-BC-K126-M)；Caspase 3活性檢測試劑盒(分光光度法)(Elabscience公司，貨號：E-CK-A311)。砂生槐子采自西藏林芝地區(qū)。

1.1.3 實驗儀器

Resona 7彩色多普勒超聲系統(tǒng)(mindray公司)；3-30 KS臺式高速冷凍離心機(SIGMA公司)；NanoDrop 2000 c超微量核酸蛋白測定儀(ThermoFisher Scientific 公司)；GeneAmp PCR System 9700 PCR基因擴增儀(ABI公司)；Light Cycler 480 II實時熒光定量PCR儀(Roche公司)；Multiskan Sky酶標儀(ThermoFisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模

實驗動物造模參照文獻[1]。通過腹腔注射原頭節(jié)的方式完成造模，4個月后通過多普勒超聲檢測，能夠看到明顯包塊者確定造模成功，見圖1。

A：超聲檢測橫截面；B：超聲檢測縱截面圖1 典型超聲圖(虛線標注為病灶范圍)Figure 1 Typical ultrasound image

1.2.2 分組

將造模成功的小鼠隨機分為砂生槐總生物堿片劑組和水劑組，每組18只。片劑組每天予TA-SM片劑，水劑組每天予TA-SM水劑，片劑組和水劑組給藥劑量為28 mg/kg/d，采用灌胃給藥。連續(xù)給藥15、30、60天時每組隨機處死6只小鼠做檢測。

1.2.3 脾臟指數(shù)、囊重指數(shù)測定

以異氟烷(流速1.5mL/min)吸入法麻醉后解剖小鼠，取脾臟、腹腔包囊進行稱重，計算脾臟指數(shù)、囊重指數(shù)(脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠總質(zhì)量×100；囊重指數(shù)=腹腔包囊質(zhì)量/小鼠總質(zhì)量×100)。

1.2.4 CD4+、CD8+、T、B相對含量測定

取出小鼠脾臟后，于70 μm細胞篩中加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)研磨，收集細胞懸液，離心(4℃，1600r/min，5min)；去上清液，再加入2 mL紅細胞裂解液，用PBS沖洗兩遍，加入0.2% BSA重懸細胞，計數(shù)后將細胞濃度調(diào)到1×107Cell/mL。吸取100 μL細胞懸液到流式管中進行抗體染色，每只流式管中加入PE-CF594 CD3e、APC CD4、PE CD8a、FITC CD19抗體各1.5 μL，以渦旋混勻后避光孵育30 min，用預(yù)冷的PBS清洗兩次去除多余的染料，用400 μL 1%多聚甲醛重懸細胞，上機檢測樣品。流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)用Flow Jo軟件分析。

1.2.5 TGF-β1、Gadd 45 γ mRNA相對表達量測定

使用Trizol法提取肝臟組織中的總RNA，檢測純度和濃度，保證OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間。mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保持。用熒光定量PCR擴增配制20 μL PCR反應(yīng)體系，預(yù)變性條件：95 ℃，30 s(循環(huán)1次)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；95 ℃，5 s(循環(huán)40次)。熔解曲線條件：60 ℃，1 min；95 ℃，0 min(循環(huán)1次)。降溫條件：50 ℃，30 s(循環(huán)1次)。用LightCycler480 System系統(tǒng)檢測得到Ct值，以2-△△Ct為統(tǒng)計量，計算目的基因的相對含量。所有樣本重復(fù)檢測3次，取平均值。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1，內(nèi)參基因選用GAPDH。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primers

1.2.6 其他相關(guān)指標測定

堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和Caspase 3活性檢測按照試劑盒說明書進行。Caspase 3活性檢測通過試劑盒利用分光光度法檢測肝組織裂解液中的吸光度，判斷Caspase 3活性蛋白活化程度。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 囊重指數(shù)和脾臟指數(shù)

2.1.1 囊重指數(shù)

予不同劑型TA-SM治療15天時，囊重指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。治療30、60天時，片劑組囊重指數(shù)明顯低于水劑組(P<0.01)。水劑組和片劑組小鼠治療時間越長效果越好(P<0.05)。詳細數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)過不同劑型的TA-SM治療后，囊重指數(shù)降低，片劑組療效優(yōu)于水劑組。

表2 以不同劑型TA-SM治療后囊重指數(shù)比較表Table 2 Comparison of sac weight index after treatment with different formulations of

2.1.2 脾臟指數(shù)

予不同劑型TA-SM治療15天時，片劑組脾臟指數(shù)高于水劑組(P<0.05)。治療30、60天時，片劑組脾臟指數(shù)高于水劑組(P<0.01)。片劑組治療時間越長效果越好(P<0.01)。詳細數(shù)據(jù)見表3。說明不同制劑對棘球蚴病模型小鼠均有效，且片劑組藥效優(yōu)于水劑組。

表3 以不同劑型TA-SM治療后脾臟指數(shù)比較表Table 3 Comparison of spleen index after treatment with different formulations of

2.2 淋巴細胞的變化情況

2.2.1 CD4+/CD8+變化情況

結(jié)果顯示，以不同劑型TA-SM治療30、60天時，片劑組脾臟組織中的CD4+/CD8+比例高于水劑組(P<0.01)。治療時間越長，水劑組和片劑組CD4+/CD8+比例越高(P<0.01)。數(shù)據(jù)詳見表4。模型小鼠感染棘球蚴病處于感染晚期(超過4月)時經(jīng)過TA-SM治療，CD4+/CD8+上升，說明不同制劑治療有效，片劑優(yōu)于水劑，治療時間越長療效越好，數(shù)據(jù)詳見表4。

表4 以不同劑型TA-SM治療后脾臟中CD4+/CD8+比較表Table 4 Comparison of CD4+/CD8+ in the spleen after treatment with different formulations of

2.2.2 T/B細胞變化情況

結(jié)果顯示，不同劑型TA-SM治療15、30天時，實驗組小鼠脾臟中的T/B<1。治療60天時，片劑組和水劑組脾臟中的T/B>1，說明細胞免疫功能正在恢復(fù)。隨治療時間延長，T/B 淋巴細胞比值增大(P<0.01)。數(shù)據(jù)詳見表5。

表5 以不同劑型TA-SM治療后脾臟中T/B比較表Table 5 Comparison of T/B in the spleen after treatment with different formulations of

2.3 基因表達水平

2.3.1 TGF-β1表達水平

治療15、30、60天時片劑組TGF-β1相對表達量明顯低于水劑組(P<0.05)。數(shù)據(jù)詳見表6。TA-SM治療后TGF-β1相對表達量降低，治療有效，片劑組優(yōu)于水劑組。

表6 以不同劑型TA-SM治療后TGF-β1相對表達量Table 6 The relative expression of TGF-β1 after treatment with different formulations of

2.3.2 Gadd45γ表達水平

機體感染棘球蚴病時，蟲體蛋白促進肝細胞TGF-β1基因高表達，從而使Gadd45γ的基因表達上調(diào)。治療30天時片劑組Gadd45γ相對表達量明顯低于水劑組(P<0.05)。數(shù)據(jù)詳見表7。實驗中小鼠肝臟中細胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子Gadd45γ相對表達量下降，說明藥物治療有效。

表7 以不同劑型TA-SM治療后Gadd45γ相對表達量Table 7 The relative expression of Gadd45γ after treatment with different formulations of

2.4 生化指標變化情況

2.4.1 ALP

當(dāng)膽汁淤積和肝膽管、肝細胞微粒體損傷時，ALP含量會上升。以不同劑型的TA-SM治療15天時，片劑組ALP明顯低于水劑組(P<0.05)；治療30、60天時，片劑組明顯低于水劑組(P<0.01)。治療時間越長，水劑組和片劑組ALP水平越低(P<0.01)。數(shù)據(jù)詳見表8。實驗組ALP水平降低說明肝功能處于恢復(fù)期，TA-SM對肝臟具有保護作用。

表8 以不同劑型的TA-SM治療后ALP變化表Table 8 Changes of alkaline phosphatase after treatment with TA-SM of different

2.4.2 GGT

GGT是肝功能和膽道功能的血清生化學(xué)指標，肝膽管損傷，膽汁淤積和肝細胞微粒體損傷時，GGT含量會上升。以不同劑型的TA-SM治療15、30、60天時，GGT變化情況均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。數(shù)據(jù)詳見表9。

表9 以不同劑型的TA-SM治療后γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶變化表Table 9 Changes of γ-glutamyl transpeptidase e after treatment with TA-SM of different

2.5 Caspase 3蛋白活性

Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase 3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，凋亡早期，Caspase 3被激活，活化的Caspase 3由兩個大亞基(17KD)和兩個小亞基(12KD)組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。從實驗結(jié)果看，不同劑型的TA-SM治療15、30、60天時，Caspase 3活性變化情況無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。隨著治療時間的延長，Caspase 3活性增強(P<0.05)。數(shù)據(jù)詳見表10。

表10 以不同劑型的TA-SM治療時Caspase 3活性變化情況表Table 10 Changes of Caspase 3 activity after treatment with different formulations of

2.6 形態(tài)學(xué)表err達結(jié)果

水劑組小鼠肝組織中出現(xiàn)炎癥因子浸潤，片劑組接近正常。各組小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)HE染色圖見圖2。

A：15d，水劑組；B：30d，水劑組；C：60d，水劑組；D：15d，片劑組；E：30d，片劑組；F：60d，片劑組(藍色箭頭所指為肝血竇中的紅細胞)圖2 病理形態(tài)學(xué)染色圖(HE染色，×20)Figure 2 The pathological and morphological staining(HE staining，×20)

3 討論

目前，棘球蚴病的治療現(xiàn)狀是以手術(shù)治療為主，藥物治療為輔[2]。根據(jù)《WHO棘球蚴病治療指南》，棘球蚴病患者需長期服用苯并咪唑類藥物阿苯達唑，但阿苯達唑存在溶解度低、結(jié)晶趨勢強、口服生物利用度差等問題，同時阿苯達唑類藥物會帶來肝損傷等副作用，患者的依從性低，嚴重限制了其在臨床上的應(yīng)用。

砂生槐屬豆科槐族槐屬，生長于西藏地區(qū)，具有極強的抗旱、耐痔薄等特性，子味略苦，可以消炎解毒，主要用于治療濕熱黃疸、痢疾、赤巴病、寄生蟲病等。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，砂生槐種子中含4種生物堿，分別為苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿和槐定堿。這4種生物堿在用于治療多房棘球蚴病時效果顯著，并且通過調(diào)節(jié)IL2、IL4、IL6、IL10等改善繼發(fā)性多房棘球蚴病小鼠的免疫功能[1，3]，與傳統(tǒng)的棘球蚴病藥物苯并咪唑類相比，具有毒副作用小的優(yōu)勢[3，4]。TA-SM水劑藥物具有良好的親水性，在生物體內(nèi)具有吸收快、血藥濃度升高迅速的特點。TA-SM片劑是以基于粘附材料海藻酸鈉和卡波姆合成的生物粘附片，通過粘附材料增加藥物在繼發(fā)性多房棘球蚴病小鼠體內(nèi)的滯留時間，從而提高藥物吸收速率，增加藥物口服生物利用度。

機體最大的免疫器官是脾臟，它由 T、B 淋巴細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞組成，其免疫狀態(tài)和功能改變對于免疫應(yīng)答有極其關(guān)鍵的作用。T 細胞在抑制多房棘球蚴病的病灶活性或清除棘球蚴病病原體過程中發(fā)揮重要作用，CD8+T細胞質(zhì)量和數(shù)量決定著多房棘球蚴病患者臨床轉(zhuǎn)歸[5，6]。在機體感染棘球蚴病時，通過抗原提呈細胞提呈抗原，誘導(dǎo)T細胞免疫，感染晚期，機體受蟲體影響，以Th2介導(dǎo)的體液免疫為主，甚至出現(xiàn)Treg細胞負調(diào)節(jié)，導(dǎo)致CD4+T細胞凋亡，CD4+/CD8+下降[7，8]。本研究中，繼發(fā)性多房棘球蚴病感染小鼠超過四個月，機體的免疫應(yīng)處于以Th2介導(dǎo)的體液免疫為主的時期，CD4+T細胞凋亡，CD4+/CD8+下降，但經(jīng)藥物治療，CD4+/CD8+上升，且TA-SM片劑組高于水劑組，提示片劑和水劑均有療效，但片劑療效高于水劑。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一組具有多種生物學(xué)功能的細胞因子，對細胞的生長、分化起重要調(diào)節(jié)作用，在多種生理、病理過程中起重要調(diào)節(jié)作用[9]。TGF-β1不但參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控，而且還參與誘導(dǎo)細胞的凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過程。棘球蚴與宿主交互作用時，會通過誘導(dǎo)炎癥性細胞因子TGF-β1參與宿主肝臟病理性損傷過程[10]。TGF-β可激活非經(jīng)典型MAPK(Mitogen Activated Protein Kinase)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細胞周期關(guān)鍵調(diào)控因子Gadd45γ，調(diào)控肝臟細胞的生長、抑制或凋亡，導(dǎo)致宿主肝臟的病理性損傷[11]。因此，當(dāng)機體感染棘球蚴病時，蟲體蛋白能夠促進肝細胞TGF-β1、Gadd45γ基因表達上調(diào)。30天片劑組TGF-β1的表達水平明顯低于水劑組，Gadd45γ的表達水平也呈現(xiàn)同樣的趨勢，說明行TA-SM治療時，抑制了蟲體蛋白導(dǎo)致的TGF-β1、Gadd45γ基因的高表達，治療有效。30天片劑組明顯低于水劑組，提示30天TA-SM片劑組的療效優(yōu)于水劑組。

研究表明，ALP和GGT是反映肝功能的重要指標，血液中ALP、GGT升高水平與肝細胞受損程度呈正相關(guān)[12]。實驗表明，小鼠感染棘球蚴病時，包囊的浸潤性生長及其造成的機械性損傷可引起血清中ALP、GGT水平顯著升高[13-15]。因此，ALP、GGT水平的檢測可反映藏藥TA-SM治療棘球蚴病小鼠時的肝臟功能狀態(tài)。治療時，ALP的給藥組明顯低于模型組，提示TA-SM對繼發(fā)性多房棘球蚴病小鼠有療效。感染多房棘球蚴病時，小鼠脾臟指數(shù)升高，脾臟代償性增大[1，4]。經(jīng)過治療，脾臟指數(shù)不同程度下降，TA-SM片劑組下降更為明顯(P<0.05)，說明TA-SM片劑組治療更有利于脾臟恢復(fù)。對囊重指數(shù)進行分析發(fā)現(xiàn)，在給藥時囊重指數(shù)下降，顯示經(jīng)藥物治療后囊腫縮小。

綜上所述，不同劑型的TA-SM治療繼發(fā)性多房棘球蚴病小鼠時，CD4+/CD8+表達上調(diào)，TGF-β1、Gadd45γ的表達水平下降，血清中的ALP含量降低，脾臟指數(shù)上升，囊重指數(shù)下降，提示TA-SM治療繼發(fā)性多房棘球蚴病小鼠有效，且片劑療效高于水劑。