巖藻多糖調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路保護神經(jīng)元免受缺氧缺糖/再灌注損傷※

巨 虎，劉川川，王 虎，樊海寧&

(1.青海大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西寧 810001；2.青海省包蟲病重點實驗室，西寧 810001；3.青海大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科，西寧 810001；4.青海省衛(wèi)生健康委員會，西寧 810001)

最新研究顯示，巖藻多糖(Fucoidan，F(xiàn)u)的使用有效降低了神經(jīng)功能缺損評分，減小了腦梗死缺血灶區(qū)域[1]，但其作用機制不明，本研究擬用缺氧缺糖/再灌注(Oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/RP)模型開展相關研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑儀器

大鼠PC12細胞、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶溶液購于武漢Procell公司；胎牛血清、馬血清購于美國Gibco公司；巖藻多糖購于美國Sigma公司；線粒體膜電位檢測試劑盒RIPA、蛋白裂解液、ECL發(fā)光液、蛋白定量試劑盒購于美國ThermoFisher公司；Annexin V FITC/PI染色試劑盒購于美國BD Biosciences公司；Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3 I/II、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin抗體購于武漢Abclonal公司；JAK2抑制劑WP1066購于Selleck公司。NanoDrop 2000紫外分光光度計、CO2細胞培養(yǎng)箱購于美國ThermoFisher公司；全自動酶標儀購于瑞士Tecan公司；三氣培養(yǎng)箱購于德國BINDER公司；蛋白電泳儀購于美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購于美國艾森公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法

大鼠PC12細胞用含有10%胎牛血清、5%馬血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基置培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)，每兩天以2/3的比例更換培養(yǎng)基。

1.2.2 OGD/RP和藥物處理方法

用1 μM的FU處理細胞24 h，再加入Earle′s平衡鹽溶液(EBSS)來制備OGD/RP模型。然后，將細胞轉(zhuǎn)移到含有5%CO2、95%N2的厭氧箱中，在37 ℃下放置4 h行缺氧處理，之后再放入含氧正常的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對照組的細胞沒有經(jīng)過OGD/RP和FU處理，而是在正常的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃，常氧條件下培養(yǎng)24h)。當加入JAK/STAT抑制劑WP1066干預時，PC12細胞用10 μM WP1066預孵育30 min，經(jīng)OGD/RP處理前用1 μM FU處理24 h。

1.2.3 細胞活力檢測方法

使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。將對數(shù)生長期的PC12細胞按照1×104個/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每組設置6個復孔，經(jīng)過不同條件的處理后，加入10 μL CCK-8試劑，根據(jù)試劑盒說明書所示方法檢測PC12細胞的活力。在450 nm處檢測各組吸光度值。

1.2.4 細胞凋亡檢測方法

使用Annexin V FITC/PI染色試劑盒按照說明書所示方法檢測PC12細胞凋亡情況。將對數(shù)生長期的PC12細胞按照1×104個/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板，每組設置3個復孔。經(jīng)過不同條件的處理后，將細胞密度調(diào)整為1×105個/管。細胞用Binding Buffer洗滌后，加100 μL Binding Buffer重懸細胞，并加入5 μL Annexin V FITC、5 μL PI，在室溫下避光染色15 min。細胞用Binding Buffer洗滌后，加200 μL Binding Buffer重懸細胞，用流式細胞儀檢測。

1.2.5 抗氧化劑酶含量檢測方法

收集經(jīng)處理后的PC12細胞上清液，用超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒按照說明書所示方法檢測細胞培養(yǎng)上清液SOD、GSH-Px含量。繪制標準曲線計算SOD、GSH-Px濃度。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)方法

使用Trizol試劑提取各組細胞總RNA。使用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，以1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性。在每組細胞的總RNA中各取2 μg RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書所示方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR特異性引物由上海生工生物公司合成，序列：HO-1 F，5′-TGC TCA ACA TCC AGC T-3′，R：5′-GCA GAA TCT TGC ACT T-3′；GCLC F，5′-CTC CTC ACA GTC ACG GCA TT-3′，R：5′-TGA ATG GAG ACG GGT TG-3′；GCLM F：5′-AAG CCA GAC ACT GAC ACA CC-3′，R：5′-ATC TGG AGG CAT CAC ACA GC-3′；β-actin F：5′-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3′，R：5′-CTC CTT AAT GTC ACG CCA CGAT-3′。按照SYBR?qPCR Master Mix檢測試劑盒配制反應體系，用Quant Studio 5熒光定量PCR儀進行PCR實驗，反應條件：95 ℃，15 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；共計40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。實驗重復三次。

1.2.7 蛋白印跡分析方法

收集各組細胞，用含有PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解各組細胞30 min，離心(4℃，12000r/min，10min)后取上清液。用BCA蛋白定量法檢測樣品總蛋白濃度。煮沸后，將蛋白樣品按照30 μg/孔在SDS-PAGE凝膠上進行電泳。電泳結束后將凝膠上的目的蛋白電轉(zhuǎn)(160mA恒流)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h。將膜置一抗Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3、LC3 I/II、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin孵育(4℃，過夜)。膜經(jīng)TBST緩沖液洗滌后，加入HRP標記的羊抗兔IgG孵育(室溫，1h)。膜經(jīng)TBST緩沖液洗滌后，用ECL超敏發(fā)光液在凝膠光成像儀下檢測特異性免疫反應蛋白條帶，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.8 活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平檢測方法

使用2′，7′-二氯熒光素-二乙酸酯(DCFH-DA)染色液染色后分析PC12細胞中的ROS水平。收集各組PC12細胞沉淀，用PBS清洗三次后，將細胞轉(zhuǎn)移到24孔細胞培養(yǎng)板(1.0×104個/孔)，加入10 μM DCFH-DA孵育(避光，30min)后用流式細胞儀分析。

1.2.9 線粒體膜電位(MMP)檢測方法

使用熒光探針JC-1檢測PC12細胞的線粒體膜電位水平。將PC12細胞加入10 μM JC-1孵育(37℃，30min)，將孵育細胞用PBS洗滌一次后加PBS重懸細胞，用流式細胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 FU抑制PC12細胞免受OGD/RP誘導的增殖抑制和避免細胞凋亡

首先，我們確定了FU對PC12細胞活力和細胞凋亡存在影響。CCK-8檢測顯示，與Control組細胞相比，OGD/RP誘導的細胞活力下降；而經(jīng)FU處理后，這種情況得到了明顯緩解。(表1)與Control組細胞相比，經(jīng)OGD/RP誘導的細胞凋亡有所增加，而經(jīng)FU處理后相較于OGD/RP組細胞凋亡率減少。(圖1，表2)用蛋白印跡法分析細胞凋亡調(diào)節(jié)因子(Bax、Bcl-2和cleaved-caspase3)發(fā)現(xiàn)，與OGD/RP誘導的細胞相比，經(jīng)FU處理24 h后Bax、cleaved-caspase3細胞凋亡蛋白表達量明顯減少，Bcl-2蛋白表達量增加。(圖2，表3)

表1 FU處理對PC12細胞增殖的影響值Table 1 Effects of FU treatment on the proliferation of PC12

圖1 經(jīng)FU處理后的PC12細胞凋亡圖Figure 1 PC12 cells apoptosis after FU treatment

表2 經(jīng)FU處理后的PC12細胞凋亡率分析結果Table 2 Analysis of PC12 cells apoptosis rate after FU

圖2 FU對PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響圖Figure 2 Effects of FU on the expression of apoptosis-related proteins in PC12 cells

表3 FU對PC12細胞凋亡相關蛋白表達的影響值Table 3 Effects of FU on the expression of apoptosis-related proteins in PC12

2.2 FU減少了由OGD/RP誘導的PC12細胞氧化應激和自噬的發(fā)生

腦損傷過程中細胞凋亡的發(fā)生伴隨有細胞自噬的改變，我們進一步檢測了FU是否能抑制OGD/RP誘導的細胞發(fā)生氧化應激和自噬。用1 μM FU處理PC12細胞24 h后再經(jīng)OGD/RP處理，經(jīng)DCFH-DA染色后用流式細胞儀分析所得結果顯示，與對照組細胞相比，OGD/RP能明顯提高細胞內(nèi)ROS水平(P<0.05)。(圖3，表4)另外，與OGD/RP誘導的細胞相比，F(xiàn)U處理降低了ROS水平(P<0.05)。(圖3，表4)由于抗氧化蛋白(如SOD、GSH-Px)具有預防氧化應激的功能，我們進一步檢測了各組細胞中這些蛋白的表達水平。經(jīng)OGD/RP處理后，SOD、GSH-Px含量明顯下降(P<0.05)。(表4)正如預期的那樣，與OGD/RP誘導的細胞相比，經(jīng)FU處理，SOD、GSH-Px表達水平顯著增加(P<0.05)。(表4)

圖3 經(jīng)FU處理后的PC12細胞中的ROS分析圖Figure 3 ROS analysis of PC12 cells after FU treatment

表4 經(jīng)FU處理后的PC12細胞ROS和培養(yǎng)上清液中SOD、GSH-Px的表達水平Table 4 Expression levels of ROS in PC12 cells and SOD，GSH-Px in supernatant after FU

值得注意的是，氧化應激通常表現(xiàn)為細胞自噬的改變，我們進一步檢測了FU處理PC12細胞后對MMP和細胞自噬的影響。結果表明，OGD/RP會導致MMP的損耗(P<0.05)，但經(jīng)FU處理可使MMP損耗減少。(圖4，表5)細胞自噬是一種應對損傷的病理生理反應，LC3是一個自噬蛋白的標志物。當自噬發(fā)生時，LC3 I被泛素化修飾，并與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3 Ⅱ。在本研究中，我們用Western blot法來檢測LC3自噬蛋白的表達水平。OGD/RP誘導的PC12細胞的LC3的表達水平增加(圖5，表5)，而經(jīng)FU處理，LC3蛋白的表達水平降低。這些結果表明，經(jīng)FU處理可以保護PC12細胞免受OGD/RP引起的氧化損傷和自噬。

圖4 經(jīng)FU處理PC12細胞線粒體膜電位圖Figure 4 Mitochondrial membrane potential of PC12 cells after FU treatment

圖5 FU對PC12細胞LC3 I/II蛋白表達的影響圖Figure 5 Effects of FU on the expression of LC3 I/II protein in PC12 cells

表5 FU對PC12細胞MMP水平和LC3 I/II蛋白表達的影響值Table 5 Effects of FU on the level of MMP and the expression of LC3 I/II protein in PC12

2.3 FU能抑制OGD/RP誘導的PC12細胞JAK2/STAT3水平

我們進一步確認了FU處理PC12細胞是否影響JAK/STAT信號通路的改變，明確了FU對OGD/RP誘導的JAK/STAT信號通路激活的影響(圖6，表6)。與Control組相比，OGD/RP能顯著增強JAK2和STAT3的磷酸化水平(P<0.05)。與OGD/RP組相比，F(xiàn)U處理能抑制OGD/RP誘導的JAK2/STAT3的激活。這些結果表明，F(xiàn)U的抗OGD/RP作用可能通過抑制JAK2/STAT3的途徑來實現(xiàn)。

圖6 FU對PC12細胞JAK/STAT信號通路蛋白表達的影響圖Figure 6 Effects of FU on the protein expression of JAK/STAT signal channel in PC12 cells

表6 FU對PC12細胞JAK/STAT信號通路蛋白表達的影響值Table 6 Effects of FU on the protein expression level of JAK/STAT signaling pathway channel in PC12

2.4 FU通過介導JAK2/STAT3信號通路實現(xiàn)對OGD/RP的抗損傷作用

為了進一步驗證FU抗OGD/RP引起的凋亡和自噬作用是否與JAK/STAT信號通路相關，我們使用JAK/STAT抑制劑WP1066后進一步檢測細胞凋亡和自噬相關改變情況。首先，我們檢測了FU和WP1066共同作用于PC12細胞后對抗氧化劑酶含量的影響。結果表明，與經(jīng)FU+OGD/RP處理的細胞相比，WP1066組的細胞培養(yǎng)上清液中抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(表7)進一步檢測經(jīng)WP1066和FU處理后的MMP水平，結果顯示，與經(jīng)FU+OGD/RP處理的細胞相比，經(jīng)WP1066處理的MMP水平增加(P<0.05)(圖7，表8)；而ROS水平有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖8，表8)。

表7 經(jīng)FU和WP1066共處理的PC12細胞培養(yǎng)上清液中SOD、GSH-Px的比較結果Table 7 Comparison of SOD and GSH-Px in PC12 cells culture supernatants co-treated with FU and

圖7 經(jīng)FU和WP1066共處理PC12細胞對MMP的影響圖Figure 7 Effects of PC12 cells co-treated with FU and WP1066 on MMP

圖8 經(jīng)FU和WP1066共處理的PC12細胞對ROS的影響的流式分析圖Figure 8 Flow cytometric analysis of PC12 cells co-treated with FU and WP1066 on ROS

表8 經(jīng)FU和WP1066共處理的PC12細胞MMP和ROS的比較結果Table 8 Comparison of MMP and ROS in PC12 cells co-treated with FU and

最后，我們研究了WP1066抑制劑對細胞凋亡和自噬相關蛋白的影響情況。蛋白印跡分析證明，與OGD/RP+FU組相比，經(jīng)WP1066處理能增強FU效果、抑制PC12細胞凋亡(P<0.05)(圖9，表9)；而LC3 I/II有減少的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖9，表9)。這些發(fā)現(xiàn)進一步表明，抑制JAK2/STAT3信號通路能加強FU抗OGD/RP引起的細胞凋亡和自噬作用。

圖9 經(jīng)FU和WP1066共處理的PC12細胞凋亡和自噬蛋白分析圖Figure 9 Apoptosis and autophagy protein analysis of PC12 cells co-treated with FU and WP1066

表9 FU和WP1066共處理對PC12細胞凋亡和自噬蛋白表達的影響值Table 9 Effects of co-treatment of FU and WP1066 on apoptosis and autophagy protein expression of PC12

3 討論

缺血性腦卒中是最常見的中風類型。它是一種常見的臨床疾病，通常會導致血管和神經(jīng)元損傷。神經(jīng)元損傷是腦缺血性卒中患者長期致殘的主要原因。然而，目前還沒有有效的方法來治療神經(jīng)損傷。因此，迫切需要篩選抗神經(jīng)元損傷藥物。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖能逆轉(zhuǎn)OGD/RP引起的細胞增殖抑制，降低細胞凋亡和自噬的發(fā)生。此外，F(xiàn)U能通過JAK1/STST3通路調(diào)節(jié)PC12細胞凋亡和自噬過程。

缺血性腦卒中發(fā)生時，以腦血管為主導的區(qū)域中心會形成核心區(qū)和周圍的缺血半影區(qū)，核心區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)壞死，缺血半影區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡(是保護的關鍵)[2]。腦缺血后，與細胞凋亡相關的蛋白，如Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3發(fā)生變化[3]。此外，有證據(jù)表明氧化應激產(chǎn)生的ROS可以介導細胞凋亡[4]。之前的研究證實，經(jīng)OGD/RP誘導后的ROS含量明顯增加[5]，這與我們的研究一致。細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡對維持環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。OGD/RP處理會抑制細胞的活力、促進PC12細胞凋亡和抑制抗氧化酶SOD、GSH-Px表達。而經(jīng)FU處理可以明顯抑制OGD/RP引起的細胞凋亡，并促進抗氧化酶SOD、GSH-Px的表達。這些結果表明FU能通過抑制細胞凋亡和促進抗氧化酶表達保護神經(jīng)元免受OGD/RP引起的損傷。

越來越多的數(shù)據(jù)證實細胞凋亡和自噬之間存在復雜關聯(lián)。自噬可以通過抑制caspase維持細胞存活[6]。自噬專門降解聚集的蛋白質(zhì)和受損的細胞器，維持細胞平衡[7]。實際上，細胞在較低的基礎水平時通過自噬來維持穩(wěn)態(tài)。先前的研究表明，自噬在早期腦損傷時具有神經(jīng)保護作用，其保護作用至少部分是通過其抗凋亡作用實現(xiàn)的。本研究顯示，F(xiàn)U能拮抗OGD/RP造成細胞線粒體膜電位升高和自噬的發(fā)生，通過使用WP1066抑制劑證實FU抑制自噬的發(fā)生是通過JAK2/STAT3信號通路來實現(xiàn)的。有證據(jù)顯示，OGD/RP可以激活自噬，被激活的自噬可能是OGD/RP導致神經(jīng)元損傷的一個因素[8]。相反，也有研究顯示，被激活的自噬對大鼠局灶性腦缺血有神經(jīng)保護作用[9]。值得注意的是，我們的研究結果與之前的研究結果不同，之前的研究認為FU以一種不依賴caspase的方式提高自噬體的含量和細胞死亡率[10]。

大量證據(jù)證明[11，12]，F(xiàn)U是JAK/STAT信號通路抑制劑，可以降低各種腫瘤細胞的STAT3激活水平，最終抑制腫瘤的生長。JAK/STAT信號通路是一條重要的細胞內(nèi)信號通路，參與了神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化、衰老等過程，并與腦缺血、腦腫瘤等神經(jīng)系統(tǒng)病理過程密切相關[13，14]。在PC12細胞中，OGD/RP損傷可上調(diào)L型Ca2+通道和促進ROS的產(chǎn)生，增加Ca2+的流入，從而觸發(fā)了包括STAT3在內(nèi)的缺氧平衡轉(zhuǎn)錄因子的表達[15]。在大鼠大腦中動脈閉塞模型中，腦組織的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中STAT3的磷酸化明顯增強[16，17]。在缺血性腦損傷中，JAK/STAT信號通路的內(nèi)在機制包括調(diào)節(jié)細胞凋亡[18]、抑制神經(jīng)炎癥[19]和改善氧化壓力[15]。目前，還沒有關于JAK/STAT信號通路調(diào)節(jié)缺血性腦損傷中神經(jīng)元自噬過程的研究。我們的研究結果顯示，對于OGD/RP誘導的PC12細胞，F(xiàn)U能抑制PC12細胞的凋亡、自噬和氧化應激反應，同時FU還能調(diào)控JAK2/STAT3信號通路增強該抑制作用。

綜上所述，F(xiàn)U使OGD/RP誘導的PC12細胞免受氧化應激、自噬和凋亡作用，F(xiàn)U的神經(jīng)保護作用可能是通過抑制JAK/STAT信號通路實現(xiàn)的。