低氧下α-MEM、DMEM高糖培養(yǎng)基對HepG2細(xì)胞線粒體Tom20表達(dá)水平及脂肪沉積量的影響※

顏然然，蔡 浩，曹學(xué)鋒，3，冉 麗，王志彪，格日力，3，白振忠，3*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；2.青海省第五人民醫(yī)院腫瘤科，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點實驗室，青海 西寧 810001)

低氧與葡萄糖含量差異都會顯著影響細(xì)胞能量代謝水平，而線粒體膜蛋白數(shù)量和脂肪沉積量是細(xì)胞能量代謝變化的直接表型。HepG2細(xì)胞是最為常用的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞株，可以直接反映正常肝細(xì)胞的代謝變化。美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞采用α-MEM(MEM Eagle，alpha modification)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或采用DMEM(high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium)高糖培養(yǎng)基[1-3]。線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶復(fù)合體蛋白20(Translocase Of Outer Mitochondrial Membrane 20，Tom20)是線粒體外膜上主要的膜轉(zhuǎn)運受體蛋白，反映細(xì)胞的線粒體物質(zhì)代謝活力。目前，對于低氧下采用不同糖含量培養(yǎng)基對細(xì)胞代謝的影響的研究未見報道。故本研究擬探究低氧下α-MEM、DMEM高糖培養(yǎng)基對HepG2細(xì)胞線粒體Tom20表達(dá)水平及脂肪沉積量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞株(普諾賽生命科技有限公司，CL-0103)；α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(普諾賽生命科技有限公司，PM150410)，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(普諾賽生命科技有限公司，PM150210)；胎牛血清(普諾賽生命科技有限公司，164210)；青鏈霉素混合液(普諾賽生命科技有限公司，PB180120)；胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司，T1350)；無菌PBS(Boster Biological Technology，PYG0021)，Cell Counting Kit-8(北京索萊寶科技有限公司，CA1210)；油紅O染色液(北京索萊寶科技有限公司，G1262)；Tom20 抗體(Cell Signaling Technology，42406S)，β-actin 抗體(Sigma-Aldrich，A5441)；Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody(Cell Signaling Technology，7074p)；低氧培養(yǎng)箱(MEMMERT)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad xMark)。

1.2 實驗方法

將HepG2細(xì)胞分為常氧α-MEM組(21%O2)、常氧DMEM組(21%O2)、低氧α-MEM組(1%O2)、低氧DMEM組(1%O2)；各組細(xì)胞接種培養(yǎng)穩(wěn)定后分組刺激72 h；分別觀察測定各時間點細(xì)胞生長密度、細(xì)胞活力，提取各組細(xì)胞蛋白，通過Western blot法檢測Tom20蛋白表達(dá)水平，固定細(xì)胞，用油紅O染色法檢測低氧下各組細(xì)胞脂肪沉積情況。具體方法如下所示：

1.2.1 HepG2細(xì)胞分組及基礎(chǔ)培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)方案采納普諾賽公司推薦方案：37 ℃，5%CO2；低氧組采用1%O2，常氧組采用21%O2。細(xì)胞培養(yǎng)基分別為α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%P/S雙抗、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%P/S雙抗。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)生長至匯合度為70%～80%時，用PBS洗滌、0.25%的胰蛋白酶消化處理細(xì)胞后按照計劃安排接種。為測定不同生長環(huán)境細(xì)胞活性、增殖毒性，接種兩組細(xì)胞(6孔板)進行CCK-8實驗，每個實驗組分別設(shè)定復(fù)孔及空白組。同時于6孔板中接種細(xì)胞行染色觀察、6cm培養(yǎng)皿中接種實驗組細(xì)胞收取蛋白進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western blot)。密切觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，各組細(xì)胞經(jīng)饑餓處理后進行刺激，低氧組O2濃度為1%，常氧組O2濃度仍為21%，刺激72 h。

1.2.2 HepG2細(xì)胞代謝檢測

更換HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基予低氧刺激，并于0、1、12、24、48、72 h時檢測各組細(xì)胞活力。操作流程如下：從培養(yǎng)箱中取出待測細(xì)胞培養(yǎng)板，向96孔板中各檢測試驗孔分別加入10 μL CCK-8檢測試劑，將細(xì)胞培養(yǎng)板置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。計算各組細(xì)胞的活力，計算公式：細(xì)胞活力(%)=[A(刺激組)-A(空白組)]/[A(無刺激組)-A(空白組)]×100%。

1.2.3 HepG2細(xì)胞增殖代謝觀察

將行細(xì)胞染色觀察的HepG2細(xì)胞分別接種于6孔板上，細(xì)胞貼壁生長后分別置α-MEM、DMEM培養(yǎng)基，并分別置1%、21%氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于刺激開始后第24、48、72 h時觀察每組細(xì)胞生長狀況，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并評估細(xì)胞密度。

1.2.4 HepG2細(xì)胞線粒體檢測

HepG2細(xì)胞以低氧刺激72 h，迅速用PBS清洗3遍后加含有1 mM濃度PMSF工作液的RIPA裂解細(xì)胞，震蕩(冰浴)30 min，離心(4℃，12000r/min)15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的無菌離心管中即為樣本蛋白。采用BCA法定量各組蛋白濃度，將各組蛋白稀釋至2 μg/μL，加入蛋白上樣緩沖液后煮沸15 min使蛋白變性。各組樣本凍存于-80 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融。WB檢測：上樣量為10 μg，電泳(80V、30min恒壓濃縮膠；120V、60min恒壓分離膠)；以300 mA恒流電場將各蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。目的條帶Tom20的分子量為16 kDa，選擇分子量為42 kDa的β-actin為內(nèi)參。依據(jù)各自分子量裁剪PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育條件：4 ℃，過夜；二抗孵育條件：室溫，1 h。將現(xiàn)配現(xiàn)用的Millipore Immobilon Western化學(xué)發(fā)光HRP底物均勻覆蓋PVDF膜(用TBST洗膜3次)后立即進行曝光。上述實驗重復(fù)3次。用ImageJ軟件(取灰度值)獲取曝光結(jié)果。

1.2.5 HepG2細(xì)胞脂肪沉積檢測

油紅O染色用于判定各組細(xì)胞中脂肪沉積情況。參照試劑盒說明書進行染色操作。首先收集的待染色細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗后，采用Oil red O(ORO)Fixative固定液固定細(xì)胞，以O(shè)RO Stain染色脂滴、Mayer蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，最后用ORO Buffer固定細(xì)胞、蒸餾水覆蓋細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察、攝像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 低氧條件下α-MEM和DMEM高糖培養(yǎng)基上的細(xì)胞生長密度

HegG2細(xì)胞暴露低氧72 h后細(xì)胞的狀態(tài)較差，如圖1所示。采用細(xì)胞匯合度計算，結(jié)果如表1所示。低氧刺激組細(xì)胞密度顯著低于常氧組；α-MEM培養(yǎng)基組細(xì)胞密度顯著低于DMEM培養(yǎng)基組。

圖1 細(xì)胞生長密度Figure 1 Cell growth density

表1 HepG2細(xì)胞生長密度Table 1 Growth density of HepG2 cells

2.2 低氧條件下α-MEM和DMEM高糖培養(yǎng)基上的細(xì)胞活力

在α-MEM、DMEM培養(yǎng)基上、1%低氧條件下培養(yǎng)72 h，CCK8實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞活力較21%O2組下降，如圖2所示。

圖2 細(xì)胞生長活力Figure 2 Cell growth viability

HepG2細(xì)胞在未行低氧刺激時，不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的常氧及低氧組細(xì)胞的活力完全相同，予1%低氧刺激后，第1 h細(xì)胞的活力明顯降低，隨后回升且逐漸升高，低氧刺激第24 h時細(xì)胞活力恢復(fù)到80%以上且趨于穩(wěn)定。整體分析低氧條件下細(xì)胞的活力比常氧條件下顯著降低，而高糖DMEM培養(yǎng)基組與α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基組的差異性變化趨同。

2.3 低氧條件下α-MEM和DMEM高糖培養(yǎng)基上細(xì)胞的脂肪沉積量

油紅O染色是檢測細(xì)胞脂肪沉積量的主要形態(tài)學(xué)方法。α-MEM培養(yǎng)基組培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞在72 h時對脂肪的攝取量較低，表現(xiàn)為脂肪團塊較小，脂滴直徑較小，顏色較淺；而在DMEM培養(yǎng)基組細(xì)胞胞質(zhì)中油紅O脂滴較大，顏色顯著增高，結(jié)果如圖3所示。低氧下HepG2細(xì)胞中脂肪沉積量顯著增加，而且DMEM較α-MEM增加更為明顯。

圖3 細(xì)胞油紅O染色圖Figure 3 Cells staining with Oil Red O

2.4 低氧下α-MEM和DMEM高糖培養(yǎng)基上的細(xì)胞Tom20表達(dá)水平

Tom20是細(xì)胞線粒體的標(biāo)志性蛋白。蛋白印跡結(jié)果如圖4所示。條帶灰度值采用ImageJ法分析，結(jié)果如表2所示，常氧下Tom20的表達(dá)水平在α-MEM中表達(dá)更高(較DMEM中)。低氧下α-MEM和DMEM培養(yǎng)基中Tom20的表達(dá)顯著減少，在DMEM培養(yǎng)基中下降更為明顯。不同培養(yǎng)基間DMEM培養(yǎng)基組Tom20表達(dá)水平降低明顯；不同氧濃度組間低氧組表達(dá)水平降低顯著。

表2 Tom20表達(dá)水平Table 2 Expression levels of Tom20

圖4 不同刺激下HepG2細(xì)胞線粒體標(biāo)志蛋白Tom20的表達(dá)圖Figure 4 Expression of mitochondrial marker protein Tom20 in HepG2 cells under different stimulations

3 討論

細(xì)胞低氧導(dǎo)致包括線粒體在內(nèi)的多種細(xì)胞器損傷，它激活了氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而產(chǎn)生大量自由基活性氧簇，損傷細(xì)胞，造成機體不可逆性損傷[4，5]。在代謝研究中，用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時，僅能維持細(xì)胞生長所需的基本能量，而DMEM培養(yǎng)基糖含量較高，可為細(xì)胞培養(yǎng)提供豐富的能量。本實驗通過研究低氧下α-MEM和DMEM培養(yǎng)基對HepG2細(xì)胞的影響，觀察細(xì)胞脂肪沉積量及Tom20的表達(dá)水平差異[6-8]，證實了低氧可以在最初階段顯著降低細(xì)胞活力，隨后逐漸升高。無論是否低氧，HegG2細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或高糖培養(yǎng)基條件下均可正常生長，但在高糖培養(yǎng)基下細(xì)胞線粒體標(biāo)志蛋白Tom20表達(dá)水平降低，脂肪沉積量增加，提示對細(xì)胞的能量限制可以增加線粒體的數(shù)目和活力，而高糖顯著抑制細(xì)胞能量活力，增加了脂肪沉積量，這一現(xiàn)象在低氧下更加明顯。

3.1 低氧條件下不同培養(yǎng)基對細(xì)胞線粒體代謝、脂肪沉積的影響

本研究結(jié)果證實了α-MEM培養(yǎng)基為細(xì)胞生長和代謝提供了較為友好的條件，但高糖培養(yǎng)基可使細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積增多。這一現(xiàn)象可能與線粒體在能量充足時細(xì)胞脂肪氧化分解能力下降有關(guān)，也可能與線粒體自噬能力下降有關(guān)[9，10]；還可能與肝細(xì)胞在常氧、高糖供應(yīng)細(xì)胞時細(xì)胞線粒體呼吸能力增高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積減少有關(guān)[11，12]。Ringel A E等報道了機體在減少卡路里攝取和供給時，可以顯著提高機體的抵御疾病和延長壽命的效果[13]。

3.2 低氧條件對線粒體代謝和脂肪沉積的影響

本研究結(jié)果還證實了低氧脅迫可顯著性降低HepG2細(xì)胞的活力，但增加了其脂肪攝取和沉積能力。脂肪攝取能力是反映細(xì)胞脂代謝氧化能力的重要指標(biāo)之一。線粒體是細(xì)胞能量代謝的中樞細(xì)胞器，低氧下細(xì)胞的多種氧化代謝酶類分子的活力受到抑制，導(dǎo)致線粒體脂肪酸氧化(Fatty acids oxidation，F(xiàn)AO)能力下降，同時細(xì)胞低氧使得細(xì)胞內(nèi)的酸性代謝物質(zhì)如H+增加造成特殊的代謝微環(huán)境[14]，從而誘發(fā)炎癥、胰島素抵抗等。

Tom家族復(fù)合體作為線粒體外膜轉(zhuǎn)運體，在線粒體的內(nèi)外膜間轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)[4]。本研究中線粒體標(biāo)志蛋白Tom20是線粒體外膜上主要的膜轉(zhuǎn)運受體。Kaufman DM等研究證實，低氧暴露使秀麗線蟲的線粒體質(zhì)量控制分子伴侶蛋白HSP70等的功能異常，導(dǎo)致大量折疊蛋白的錯配和聚集，從而導(dǎo)致線粒體的數(shù)量下降和更新能力顯著降低[15]。Tom20對氧化應(yīng)激尤為敏感，Madhu V證實低氧活化HIF-1蛋白導(dǎo)致線粒體的有氧氧化能力減弱，并誘發(fā)BNIP3啟動的線粒體自噬增加，影響體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的生長和增殖[16]，我們也證實低氧可以抑制線粒體Tom20蛋白表達(dá)數(shù)量。我們還發(fā)現(xiàn)，Tom20在低氧時表達(dá)水平顯著下降，在高糖培養(yǎng)基上表達(dá)水平下降更為明顯，提示低氧進一步妨礙了高糖培養(yǎng)基導(dǎo)致的線粒體損傷。Woo C[17]等研究發(fā)現(xiàn)，低氧損傷了細(xì)胞，引起線粒體功能異常、數(shù)目顯著下降，致使炎癥-低氧和脂肪沉積的惡性循環(huán)，表現(xiàn)為低氧影響線粒體自噬、質(zhì)量控制和線粒體呼吸，致線粒體損傷，加速脂肪沉積。

本研究也存在部分問題，如我們采用的HepG2細(xì)胞株是肝癌細(xì)胞，具有部分腫瘤細(xì)胞的表型特征，是否能反映正常肝細(xì)胞的影響還不得而知。

本研究顯示，低氧顯著抑制了HepG2細(xì)胞活力，但僅限于初期，隨后有所改善。高糖培養(yǎng)基可以顯著影響線粒體功能，改變脂肪沉積，這一效應(yīng)在低氧下被進一步放大，提示在高原低氧的特殊環(huán)境下，高糖飲食會進一步增加肝細(xì)胞的脂肪儲存，不利于改善脂肪肝。