薰衣草精油納米乳的制備及其體外抑菌活性研究

錢 雪，王曉東，陳 斌，羅偉康，楊建新，李海濤，黃曉德

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211111；3.丹東市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務中心，遼寧 丹東 118017；4.伊犁紫蘇麗人生物科技有限公司，新疆 伊犁 835008）

薰衣草（Lavandula angustifoliaMill.）為唇形科薰衣草屬植物。薰衣草精油是從薰衣草中提取出來的揮發(fā)性成分，具有特殊的芳香，主要含有芳樟醇、乙酸芳樟脂、薰衣草醇和樟腦等多種成分［1-2］，其中芳樟醇和乙酸芳樟脂的含量占薰衣草精油含量的70%以上［3-4］，具有抑菌、抗炎、抗焦慮等作用［5-7］，在化妝品和醫(yī)藥方面有廣泛的用途，如降血壓、治療燒傷、安神助眠等［8-10］。但薰衣草精油水溶解度低、易揮發(fā)、不易儲存且生物利用度較低，致使其應用受到了限制。納米乳是一種粒徑為10～100 nm的膠體分散體系，是穩(wěn)定的熱力學系統(tǒng)，主要由油、水、表面活性劑和助表面活性劑組成［11］。精油制成的納米乳具有質(zhì)量穩(wěn)定、不易揮發(fā)、保存時間長、可長久留香和精油功效作用持久等特點［12-14］。近年來，將植物精油制備成不同載藥體系的研究越來越多，然而對薰衣草精油納米乳的研究相對較少。

因此，為了有效提高薰衣草精油的穩(wěn)定性和生物利用度，實驗中以薰衣草精油為主藥和油相，采用相轉(zhuǎn)變法制備薰衣草精油納米乳，偽三相圖法篩選最優(yōu)表面活性劑和助表面活性劑，得到最優(yōu)配方，并考察納米乳理化性質(zhì)和抑菌活性，為薰衣草精油的開發(fā)利用提供基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

薰衣草精油，宏芳香料（昆山）有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）由南京野生植物綜合利用研究院提供。

1.2 試劑

吐溫-80（Tween-80），南京古田化工有限公司；氫化蓖麻油（CO-40）、蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、1，2-丙二醇和甘油，山東優(yōu)索化工科技有限公司產(chǎn)品；聚乙二醇-400（PEG-400），國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水（自制）；其他試劑為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器

BSA423S電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；Zetasizer Nano ZS90激光粒度儀（英國Malvern公司）；Tecnai 12透射電子顯微鏡（荷蘭Philips公司）；FE 28 pH計（梅特勒-托力多儀器（上海）有限公司）。

2 試驗方法

2.1 薰衣草精油納米乳制備方法

將油相和表面活性劑按比例混合均勻，向其中緩慢滴加蒸餾水，邊加邊攪拌，開始時體系黏度較低，形成油包水（W/O）型納米乳，隨著水量的增加，體系黏度逐漸增加，繼續(xù)滴加蒸餾水，體系又會突然由黏變稀，此時W/O型納米乳發(fā)生轉(zhuǎn)相，即形成水包油（O/W）型薰衣草精油納米乳［15］。

2.1.1 表面活性劑的選擇

選用乳化效果較好的Tween-80、CO-40和EL-40作為表面活性劑，按表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8和1：9混合，攪拌均勻，繼續(xù)振蕩下，用蒸餾水滴定，觀察是否有澄清透明的納米乳形成［16］。

2.1.2 助表面活性劑的選擇

將CO-40與無水乙醇、1，2-丙二醇、甘油和PEG-400分別按3：1混合，按混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8和1：9混合，攪拌均勻，繼續(xù)振蕩下，用蒸餾水滴定，觀察是否有澄清透明的納米乳形成［15］。

2.1.3 Km值的確定

Km值為表面活性劑和助表面活性劑比值［15］。將表面活性劑與助表面活性劑按質(zhì)量比為2：1、3：1、4：1混勻，然后分別與精油按質(zhì)量比為9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混合，攪拌均勻，繼續(xù)振蕩下，用蒸餾水滴定，觀察是否有澄清透明的納米乳形成。

2.1.4 薰衣草精油納米乳配方的優(yōu)化

根據(jù)選定的表面活性劑、助表面活性劑和Km值，采用偽三相圖法確定納米乳最優(yōu)配比。分別按混合表面活性劑與精油質(zhì)量比9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9混合，攪拌均勻，用蒸餾水滴定，觀察是否有澄清透明的納米乳形成，并對制備的納米乳加蒸餾水稀釋后觀察其穩(wěn)定性情況［17］。

2.2 薰衣草納米乳的質(zhì)量評價

2.2.1 乳劑類型的判別

根據(jù)染料蘇丹紅和亞甲基蘭在納米乳中的擴散快慢進行判別，若紅色擴散速度快，則為油包水（W/O）型；若藍色擴散速度快，則為水包油（O/W）型［18］。

2.2.2 pH值

取適量薰衣草精油納米乳，用pH計測試其pH值。

2.2.3 粒徑分布及多分散系數(shù)

取薰衣草精油納米乳1 mL，裝入比色皿中，采用粒徑分析儀測定納米乳的粒徑分布、多分散性系數(shù)和電位分布。

2.2.4 微觀形態(tài)觀察

取適量納米乳，滴在有支撐膜的銅網(wǎng)上，使其自然晾干，后滴加2%磷鎢酸溶液，負染，揮干，用透射電子顯微鏡觀察［18］。

2.3 納米乳中薰衣草精油含量的測定

2.3.1 紫外檢測波長的選擇

配制一定濃度的薰衣草精油甲醇溶液，以甲醇為空白，進行紫外波長掃描，確定其測定波長。

2.3.2 標準曲線的建立

制備薰衣草精油溶液標準系列濃度（0.048、0.144、0.240、0.336和0.432 mg/mL），以甲醇為空白，在231 nm波長處測吸光度（A）。

2.3.3 溶液的制備

精密吸取薰衣草精油納米乳1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇5 mL破乳，超聲10 min，用甲醇稀釋至刻度，再精密吸取破乳液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得樣品溶液。稱取不含薰衣草精油的納米乳樣品1 mL，同法制備，做陰性對照溶液。

2.4 薰衣草精油納米乳抑菌活性

納米乳抑菌圈直徑：參考文獻的方法［19-20］，稍作修改。用濾紙片法測量抑菌圈直徑，用二甲基亞砜將薰衣草精油稀釋至與納米乳中精油濃度相同，以生理鹽水為溶劑，配制濃度為5.00 mg/mL的青霉素標準液。將已滅菌的固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，供試菌種均勻的涂布在培養(yǎng)基上，靜置10 min。已滅菌的6 mm濾紙片放置在培養(yǎng)基上，取10μL樣品置于濾紙片上。放置培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，測量其抑菌直徑，平行測定3次。

3 結果與分析

3.1 薰衣草精油納米乳制備

3.1.1 表面活性劑的選擇

結果表明，Tween-80不可與精油形成納米乳，故不宜選用；EL-40在表面活性劑與精油質(zhì)量比在9：1～7：3可形成納米乳，6：4～1：9不可形成納米乳；CO-40表面活性劑與精油質(zhì)量比在9：1～6：4可形成納米乳，5：5～1：9不可形成納米乳。通過繪制偽三元相圖分析，如圖1所示，與EL-40形成的乳區(qū)面積相比，CO-40作為表面活性劑時所形成的納米乳區(qū)域面積更大。因此，可選擇CO-40作為表面活性劑進行以下實驗。

圖1 EL-40與CO-40制備薰衣草精油納米乳的偽三元相圖Fig.1 Pseudo ternary phase diagram of lavender essential oil nanoemulsion prepared by EL-40 and CO-40

3.1.2 助表面活性劑的選擇

在納米乳中添加助表面活性劑可使形成的乳液更穩(wěn)定。結果表明，以無水乙醇為助表面活性劑時，混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1～7：3可形成納米乳，6：4～1：9不可形成納米乳；以1，2-丙二醇為助表面活性劑時，混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1～7：3可形成納米乳，6：4～1：9不可形成納米乳；以甘油為助表面活性劑時，混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1～8：2可形成納米乳，7：3～1：9不可形成納米乳；以PEG-400為助表面活性劑時，混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1～6：4可形成納米乳，5：5～1：9不可形成納米乳。通過繪制偽三元相圖分析，如圖2所示，與無水乙醇、1，2-丙二醇和甘油形成的乳區(qū)面積相比，PEG-400作為助表面活性劑時所形成的納米乳區(qū)域面積更大。因此，選擇PEG-400作為納米乳的助表面活性劑。

圖2 不同助表面活性劑制備薰衣草精油納米乳的偽三元相圖Fig.2 Pseudo-ternary phase diagrams of lavender essential oil nanoemulsions prepared with different co-surfactants

3.1.3 Km值的確定

Km值結果表明，當Km為2：1時，混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1～7：3可形成納米乳，6：4～1：9不可形成納米乳；Km為3：1時，混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1～6：4可形成納米乳，5：5～1：9不可形成納米乳；Km為4：1時，混合表面活性劑與精油質(zhì)量比為9：1～8：2可形成納米乳，7：3～1：9不可形成納米乳。通過繪制偽三元相圖分析，如圖3所示，與Km為2：1和4：1形成的乳區(qū)面積相比，Km為3：1時所形成的納米乳區(qū)域面積更大。因此，選擇Km為3：1作為表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比。

圖3 Km為2：1、3：1和4：1制備薰衣草精油納米乳的偽三元相圖Fig.3 Pseudo ternary phase diagrams of lavender essential oil nanoemulsions prepared with Kmof 2：1，3：1 and 4：1

3.1.4 薰衣草精油納米乳配方的優(yōu)化

結果表明，混合乳化劑與薰衣草油質(zhì)量比為9：1、8：2、7：3、6：4時，形成澄清透明的納米乳。但由表1可知，當混合乳化劑與薰衣草精油質(zhì)量為6：4、7：3時形成的薰衣草油納米乳澄清度和穩(wěn)定性相對較差；另考慮盡量減少表面活性劑用量和提高載藥量，故選擇混合乳化劑與薰衣草精油質(zhì)量比為8：2。

表1 薰衣草精油納米乳稀釋后外觀性質(zhì)情況Tab.1 Appearance and properties of lavender essential oil na?noemulsion after dilution

綜合前面篩選的結果，可以確定薰衣草精油納米乳最佳配方為：表面活性劑CO-40 20.91%、助表面活性劑PEG-400 6.97%、薰衣草精油6.97%和蒸餾水65.15%。

按上述配方和制備方法制備的薰衣草精油納米乳澄清、透明、流動性好，無分層現(xiàn)象。

3.2 薰衣草納米乳的質(zhì)量評價

3.2.1 乳劑類型的判別

根據(jù)染料蘇丹紅和亞甲基蘭在納米乳中的擴散快慢進行判別，結果顯示，納米乳中藍色擴散速度快，則該納米乳為水包油O/W型。

3.2.2 pH值

結果表明，薰衣草納米乳pH值為5.47±0.03。

3.2.3 粒徑分布及多分散系數(shù)

激光粒度分析儀測定納米乳的粒徑電位大小及分布，結果如圖4-5所示，納米乳平均粒徑為23.79±0.30 nm，多分散系數(shù)為0.443±0.12，電位為-2.68±0.37 mV，呈正態(tài)分布。本實驗納米乳粒徑大小在10～100 nm范圍內(nèi)，大小符合要求，分散系數(shù)良好。

圖4 薰衣草精油納米乳的粒徑分布圖Fig.4 The particle size distribution of lavender essential oil nanoemulsion

3.2.4 微觀形態(tài)觀察

將薰衣草納米乳置于透射電子顯微鏡下觀察，結果如圖6所示，薰衣草精油納米乳呈球形，分布均勻，分散性良好。

圖6 薰衣草精油納米乳的透射電鏡圖Fig.6 Transmission electron micrograph of lavender essential oil nanoemulsion

3.3 納米乳中薰衣草精油含量的測定

3.3.1 紫外檢測波長的選擇

薰衣草精油在231 nm附近有最大吸收峰，因此選擇231 nm作為波長進行以下測定。

3.3.2 含量測定

根據(jù)所配濃度梯度對照品測定結果，以吸光度（A）為縱坐標、薰衣草精油濃度（C）為橫坐標（mg/mL），繪制標準曲線并擬合回歸方程：A=4.95C-0.126 2（R2=0.993 7）。計算可得納米乳中薰衣草精油含量為53.95±1.12 mg/mL。

3.4 薰衣草精油納米乳抑菌活性

抑菌效果由表2可知，薰衣草精油和薰衣草精油納米乳對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有不同程度的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制效果更佳，且薰衣草精油納米乳的抑菌效果比薰衣草精油更顯著，抑菌圈直徑分別為13.67±0.33 mm和9.75±0.20 mm，約1.4倍。對大腸桿菌抑制效果次之，薰衣草精油納米乳和薰衣草精油對大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為11.87±0.13 mm和8.93±0.16mm，約1.3倍。結果表明，將薰衣草精油制備成納米乳，可以提高抑菌效果。造成這種現(xiàn)象的原因可能是納米乳中的小脂質(zhì)顆粒能夠促進精油與細胞膜緊密接觸，精油中的疏水分子能夠破壞細胞膜，導致細菌死亡；而純精油由于水溶性較低不易與細胞膜接觸，從而抑制其相互作用，導致抑制細菌能力下降［21-22］。

圖5 薰衣草精油納米乳的電位分布圖Fig.5 Potential distribution diagram of lavender essential oil nanoemulsion

表2 薰衣草精油和精油納米乳抑菌結果Tab.2 Antibacterial results of lavender essential oil and essen?tial oil nanoemulsion

4 討論

納米乳又稱微乳，是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑等按適當比例形成的，其乳滴多為球型，大小比較均勻，透明或半透明，因此輔料的選擇和配比極為重要。本試驗以薰衣草精油為油相，采用形成乳區(qū)面積最大的CO-40和PEG-400作為表面活性劑和助表面活性劑，結合偽三相圖法篩選輔料用量少、載藥量大的納米乳配方，最終確定制備精油納米乳的最優(yōu)配方為表面活性劑CO-40 20.91%、助表面活性劑PEG-400 6.97%、薰衣草精油6.97%和蒸餾水65.15%。所制備的納米乳澄清、透明、穩(wěn)定性好，平均粒徑為23.79±0.30 nm，多分散系數(shù)為0.443±0.12，透射電鏡觀察納米乳呈球形，分布均勻，分散性良好。

植物精油也是一種天然的抑菌劑，薰衣草精油中所含的芳樟醇、薰衣草醇和樟腦等對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌等的生長均有抑制作用［23-25］。本研究成功研制了薰衣草精油納米乳，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為受試菌進行抑菌活性研究，試驗證明薰衣草精油納米乳對受試菌均有較好的抑制作用，且較薰衣草精油抑菌效果更強。本試驗制備的納米乳工藝簡單、材料安全，有效解決了薰衣草精油的溶解度差、易揮發(fā)等問題，增強了抑菌作用，為今后薰衣草精油在化妝品或其他領域中的應用提供了依據(jù)和參考，但其具體機理或?qū)ζ渌N的抑菌效果還有待進一步研究驗證。