以a7nAChR為靶點治療急性呼吸窘迫綜合征及相關(guān)機制

李孟秦，王飛，楊秋燕，黃丹，曹小平

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科；2.南充市第五人民醫(yī)院骨科，四川 南充 637000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute Respiratory disease syndrome，ARDS)是由于各種肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷。典型病理改變?yōu)閺浡苑伍g質(zhì)和肺泡水腫、肺實變，頑固性低氧血癥是典型臨床表現(xiàn)[1]。ARDS的發(fā)病機制復(fù)雜，炎癥介導(dǎo)的損傷對其發(fā)生發(fā)展有重要作用。因此，通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)治療ARDS一直是臨床及基礎(chǔ)研究的方向之一，但目前尚無確切有效的藥物治療方法[2]。Th17 細胞是繼Th1、Th2 細胞之后適應(yīng)性免疫應(yīng)答的又一效應(yīng)細胞，是典型的促炎因子[3]，可誘導(dǎo)IL-6 和TNF-α表達。越來越多的研究[4]發(fā)現(xiàn)，膽堿能抗炎途徑(CAIP)在肺損傷的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。CAIP是基于迷走神經(jīng)遞質(zhì)ACh 與免疫細胞的煙堿乙酰膽堿受體(a7nAChR)結(jié)合，從而抑制促炎細胞因子的釋放[5]。正向調(diào)控a7nAChR 可強有力抑制炎癥，有應(yīng)用于治療炎癥性疾病治療的前景，如炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎、哮喘[6]。膽堿酯酶抑制劑導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)興奮能減少鏈脲霉致糖尿病小鼠脾臟炎癥因子合成及Th17 分化[7]。擬膽堿藥物α7nACHR 激動劑是否能抑制Th17 反應(yīng)性，從而減輕ARDS目前尚未見報道。本研究通過臨床研究及動物實驗探討a7nAChR激動劑的肺保護作用及可能的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 選取2019年9月至2021年9月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科收治的44例ARDS患者為研究對象，依據(jù)吸煙史分為吸煙組(n=30)和非吸煙組(n=14)，兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；依據(jù)ARDS基礎(chǔ)病因分為肺內(nèi)-ARDS組(n=31)與肺外-ARDS組(n=13)，兩組患者在吸煙組與非吸煙組的比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。納入標準：依據(jù)2012柏林定義診斷為ARDS的男性患者，年齡20～70歲。排除標準：(1)合并免疫缺陷的患者；(2)肺結(jié)核活動期、肺癌、COPD等慢性肺部疾病導(dǎo)致急性呼吸衰竭的患者。

表1 患者臨床資料比較

1.1.2 實驗動物 清潔級6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠，體重約20 g。購自川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

1.1.3 藥物、試劑及主要儀器 LPS(索萊寶)；SYBR RT-PCR 試劑盒(寶生物工程有限公司)；ELISA試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；β-actin 抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，中國)；兔抗RORγt(Abcam 公司，英國)；GTS-21(MCE公司，美國)；MLA(MCE公司，美國)；choline(Fisher Scientific，美國)；α-bungarotoxin(sigma，美國)。YS100 光學(xué)顯微鏡(日本尼康株式會社)；JYSCZ2 SDS-PAGE 蛋白電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

1.2 方法

1.2.1 患者血漿白介素16及17(IL-6、IL-17)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度檢測 患者入院后24 h內(nèi)抽取患者外周血，采用 ELISA法檢測，操作嚴格試劑盒說明書進行。

1.2.2 實驗動物分組、造模及標本收集 24只小鼠隨機分對照組、LPS組、LPS+a7nAChR激動劑組、LPS+a7nAChR抑制劑組，每組各6只。4%水合氯醛(約0.1 mL/10 g)小鼠麻醉后建立ARDS小鼠模型：建立人工氣道后，通過氣管導(dǎo)管對照組給予等體積 PBS溶液，其余3組小鼠給予緩慢推注 50 μL無菌 LPS 溶液(濃度 1 μg/μL，總量 5 mg/kg)。建立ARDS模型前1 h，LPS+a7nAChR激動劑組小鼠予以腹腔注射choline (10 mg/kg)、LPS+a7nAChR抑制劑組小鼠予以腹腔注射α-bungarotoxin (1 μg/kg)，其余兩組小鼠給予腹腔注射等體積PBS溶液。在建立ARDS模型后48h水合氯醛麻醉后頸椎脫位法處死小鼠，行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。打開胸腔，剪取肺組織。

1.2.3 肺組織HE染色 分離左上肺組織，10%多聚甲醛固定過夜、包埋、切片、HE 染色。隨機選取5個視野觀察，并依據(jù)美國胸科協(xié)會提出的肺損傷評分標準進行評分。

1.2.4 肺濕/干比重檢測 取右肺組織，放置于事先稱重的EP管中稱量肺濕重，再將樣本置于 80 ℃ 烤箱 48 h 至恒重后稱其干重。然后計算肺濕/干比重。

1.2.5 小鼠炎癥因子水平檢測 將BALF離心，收集上清液，用ELISA法檢測BALF 中IL-17、IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 RT-PCR檢測 提取左下肺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄后根據(jù) RT-PCR 試劑盒說明書進行RT-PCR 實驗。采用2- ΔΔ Ct法來測定RORγt基因相對表達量,內(nèi)參為β-actin，重復(fù)3次,取平均值。

1.2.7 Western blot檢測 提取左下肺組織總蛋白。根據(jù)Western blot 試劑盒說明書進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，采用抗 anti-RORγt(1∶500)。二抗孵育后成像，計算灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 吸煙對ARDS患者血漿中IL-17水平的影響

吸煙組ARDS患者血漿中IL-17水平低于非吸煙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 吸煙對ARDS患者血漿中TNF-α水平的影響

吸煙組ARDS患者血漿中TNF-α水平低于非吸煙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 吸煙對ARDS患者血漿中IL-6水平的影響

吸煙組ARDS患者血漿中IL-6水平低于非吸煙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 a7nAChR激動劑減輕LPS導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷

與對照組相比，所有肺損傷小鼠均出現(xiàn)典型的急性肺損傷表現(xiàn)，包括肺泡水腫、肺泡間隔增厚及炎細胞浸潤。對照組肺損傷評分低于其余3組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組肺損傷評分低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組肺損傷評分高于LPS組(P<0.05)。對照組肺組織濕/干比低于其余3組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組肺組織濕/干比低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組肺組織濕/干比高于LPS組(P<0.05)。見圖4、圖5及圖6。

2.5 a7nAChR激動劑減輕小鼠肺部炎癥反應(yīng)

以小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥因子IL-17、IL-6、TNF-α濃度評價肺部炎癥反應(yīng)水平，結(jié)果顯示，對照組小鼠BALF中IL-17、IL-6、TNF-α濃度低于其余三組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組小鼠BALF中IL-17、IL-6、TNF-α濃度低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組小鼠BALF中IL-17、IL-6、TNF-α濃度高于LPS組(P<0.05)。見圖7。

2.6 a7nAChR激動劑下調(diào)小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平

對照組小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平低于其余三組(P<0.05)，LPS+a7nAChR激動劑組小鼠肺組織蛋白及mRNA水平低于LPS組(P<0.05)，LPS+a7nAChR阻斷劑組小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平高于LPS組(P<0.05)。見圖8。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在男性ARDS患者中，吸煙者與非吸煙者相比，外周血中IL-17、IL-6、TNF-α水平低于非吸煙者(P<0.05)。類似的研究還有炎性腸病患者結(jié)腸黏膜中吸煙者比非吸煙者細胞因子水平顯著降低[8]，Guslandi M發(fā)現(xiàn)尼古丁可有效治療部分炎性腸病患者[9]，表明ARDS患者外周血中IL-17、IL-6、TNF-α水平降低可能與煙堿受體興奮有關(guān)。

動物實驗研究[10]發(fā)現(xiàn)，a7nAChR激動劑可減輕LPS導(dǎo)致的小鼠肺損傷評分及肺組織濕/干比重(P<0.05)，而抑制a7nAChR使小鼠肺損傷評分及組織濕/干比重增加(P<0.05)，與Ravikumar A.Sitapara等報道一致，提示a7nAChR可能是干預(yù)ARDS的重要靶點。炎癥反應(yīng)已被證實在ARDS的發(fā)展中有重要作用[11]，IL-17、IL-6、TNF-α均為重要的炎癥因子。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠BALF中炎癥因子IL-17、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)，a7nAChR激動劑使其降低(P<0.05)，而a7nAChR抑制劑使其升高(P<0.05)，與膿毒癥的相關(guān)研究[12]一致，說明a7nAChR激動劑可能通過下調(diào)炎癥反應(yīng)發(fā)揮肺保護作用。

Th17細胞已被證實可促進中性粒細胞的募集，發(fā)揮強大的促炎作用[13]。IL-17是Th17細胞關(guān)鍵的效應(yīng)分子之一，是典型的可誘導(dǎo)IL-6和TNF-α表達的促炎細胞因子[14]。抑制Th17可減輕肺部炎癥反應(yīng)[15]，而RORγt是調(diào)控Th17細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肺損傷小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水平均升高(P<0.05)，a7nAChR激動劑可下調(diào)肺損傷小鼠肺組織RORγt蛋白及mRNA水(P<0.05)，而a7nAChR抑制劑進一步促進其表達(P<0.05)，提示興奮a7nAChR可能通過在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平抑制RORγt表達，從而抑制Th17分化。

綜上所述，a7nAChR可能是治療ARDS的潛在靶點，興奮a7nAChR可能通過抑制RORγt表達，降低Th17細胞反應(yīng)性，減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮肺保護作用。