PI3K/Akt信號(hào)通路在SLE患者中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成中的作用

蔣瑤，祝靜，邢艷

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；川北醫(yī)學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系；3.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川 南充 637000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種經(jīng)典的全身性自身免疫性疾病，在我國(guó)患病人數(shù)為全球之最，患病率高達(dá)(7.4～10)/10萬(wàn)，男女發(fā)病比例約為1∶9[1]。SLE可由遺傳、激素、環(huán)境等多因素共同致病，但其發(fā)病核心在于自身抗原暴露、免疫耐受喪失，從而導(dǎo)致體內(nèi)免疫調(diào)控紊亂[2]。而中性粒細(xì)胞作為啟動(dòng)固有免疫的一線細(xì)胞，早期研究發(fā)現(xiàn)其凋亡異?？蓞⑴cSLE發(fā)病[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞一種新的死亡形式—中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)，可釋放大量自身抗原參與SLE的發(fā)生。SLE患者體內(nèi)NETs過(guò)度產(chǎn)生，但其分子機(jī)制不清[4]。PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活等[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路的異常活化參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)等，但SLE患者體內(nèi)NETs過(guò)度產(chǎn)生是否受PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控目前尚不明確。本研究擬運(yùn)用佛波酯(PMA)、SLE混合血清、PI3K/Akt抑制劑及二者聯(lián)合刺激中性粒細(xì)胞，探討其在SLE患者體內(nèi)NETs形成中的作用，為SLE疾病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 2019年2月至2019年12月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的20例SLE活動(dòng)期患者，全部病例均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology，ACR)修訂的SLE分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且所有研究對(duì)象無(wú)其他風(fēng)濕性疾病及原發(fā)性急慢性疾病。SLE患者疾病活動(dòng)度評(píng)分采用SLEDAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]。6例健康體檢者，均符合下列要求：(1)無(wú)SLE及其他自身免疫性疾病史和家族史；(2)無(wú)感染及慢性病史；(3)近期身體無(wú)任何不適。

1.1.2 試劑及主要儀器 PolymorphPrepTM多型核細(xì)胞分離液購(gòu)自挪威axis-Ahield公司；Sytox?Green Nucleic Acid Stain購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)博士德公司；LY294002(PI3K抑制劑)、MK2206(Akt抑制劑)購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；CD45-PerCP購(gòu)自美國(guó)BD公司；PMA購(gòu)自美國(guó)sigma公司；臺(tái)盼藍(lán)染色液(0.4%)購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司；瑞氏-姬姆薩染液購(gòu)自珠海貝索生物公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 中性粒細(xì)胞分離 采集健康體檢者外周靜脈血10 mL，2 h內(nèi)用密度梯度離心法分離中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)，PBS洗滌3次后，用2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640重懸細(xì)胞。

1.2.2 PMN純度及活性鑒定 取上述10 μL PMN懸液均勻涂抹在玻片上，利用瑞氏-吉姆薩染液進(jìn)行染色，自然風(fēng)干后顯微鏡下計(jì)數(shù)PMN所占比例。取100 μL上述PMN細(xì)胞懸液及4 μL CD45-PerCP到流式管內(nèi)，重復(fù)孵育-洗滌操作3遍后，PBS重懸細(xì)胞后在流式分析儀上分析細(xì)胞純度。取90 μL上述PMN懸液與10 μL濃度為0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液于EP管內(nèi)混勻，后吸取10 μL到牛鮑計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下計(jì)數(shù)未藍(lán)染細(xì)胞所占比例。

1.2.3 SLE患者混合血清收集 采集SLE患者全血4 mL于無(wú)抗凝劑采血管內(nèi)，8 h內(nèi)250 g離心5 min后留取上清，-80 ℃保存待用。

1.2.4 PI3K抑制劑(LY294002)及Akt抑制劑(MK2206)處理PMA和SLE混合血清 吸取上述分離得到的3×105個(gè)PMN到24孔板，分為抑制組、抑制劑+PMA組、PMA組及抑制組、抑制劑+SLE混合血清組、SLE混合血清組，每組3個(gè)復(fù)孔，毎孔500 μL。具體分組處理為：(1)抑制組：加入10 μM LY294002或25 nM MK2206；(2)抑制劑+PMA組：加入10 μM LY294002或25nM MK2206處理30 min后，再給予2 nM PMA刺激90 min；(3)PMA組：加入2 nM PMA；(4)抑制劑+SLE混合血清組：加入10 μM LY294002或25 nM MK2206處理30 min后，再加入100 μL SLE混合血清刺激120 min；(5)SLE混合血清組：加入100 μL SLE混合血清。在孵育結(jié)束前30 min，各孔加入5 μM Sytox Green，孵育相應(yīng)時(shí)間后，各組同步結(jié)束并上機(jī)檢測(cè)各孔熒光強(qiáng)度。

1.2.5 PI3K抑制劑(LY294002)及Akt抑制劑(MK2206)處理PMN 吸取上述分離得到的3×105個(gè)PMN到24孔板，以不加入或加入10 μM LY294002及25nM MK2206分別作為對(duì)照組及處理組，每組3個(gè)復(fù)孔，毎孔500 μL，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min后上機(jī)檢測(cè)各孔熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 分離的PMN純度及活性

分離PMN后，經(jīng)瑞士染色在光學(xué)顯微鏡下分類(lèi)計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞，PMN純度>95%；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PMN純度>95%；臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離的PMN活性>95%，達(dá)到體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要求。見(jiàn)圖1。

2.2 LY294002抑制PMA和SLE混合血清刺激PMN形成NETs

PMN在加入或不加入PI3K抑制劑LY294002或PMA刺激情況下，檢測(cè)到各組NETs水平分別為：LY294002組(168±78.08)、LY294002+PMA組(310±182.77)、PMA組(840.20±334.54)，即LY294002能明顯抑制PMA刺激的NETs形成(P=0.005)；PMN在加入或不加入PI3K抑制劑LY294002或SLE混合血清刺激的情況下，檢測(cè)到各組NETs水平分別為：LY294002組(269.33±141.51)、SLE血清+LY294002組(419.33±196.83)、SLE血清組(703±266.71)，表明LY294002能明顯抑制SLE血清誘導(dǎo)的NETs形成(P=0.004)。見(jiàn)圖2。

2.3 MK2206抑制PMA和SLE混合血清刺激PMN形成NETs

PMN在加入或不加入Akt抑制劑MK2206或PMA刺激的情況下，檢測(cè)到各組NETs水平分別為：MK2206組(130.20±53.18)、MK2206+PMA組(593±224.93)、PMA組(842.60±307.04)，即MK2206能明顯抑制PMA刺激的NETs形成(P=0.007)；PMN在加入或不加入Akt抑制劑MK2206或SLE混合血清刺激的情況下，檢測(cè)到各組NETs水平分別為：MK2206組(279.33±92.24)、MK2206+SLE混合血清組(500.67±271.53)、SLE混合血清組(784.50±348.28)，即MK2206能明顯抑制SLE混合血清誘導(dǎo)的NETs形成(P=0.009)。見(jiàn)圖3。

2.4 MK2206抑制PMN自發(fā)形成NETs

與對(duì)照組相比，Akt抑制劑MK2206與PMN共培養(yǎng)90 min后的NETs水平降低[(138.67±52.11)vs.(210.33±80.66)，P=0.03]，表明MK2206能通過(guò)抑制Akt活化而減少NETs的自發(fā)形成；但PI3K抑制劑LY294002無(wú)此作用[(168±78.08)vs.(220.60±87.03)，P=0.15]，表明在PMN自發(fā)形成NETs的過(guò)程中，有活化Akt的參與，但其上游調(diào)控蛋白可能不是PI3K。見(jiàn)圖4。

3 討論

SLE是一種全身性自身免疫性疾病，可累及多個(gè)器官組織，以自身抗原暴露、免疫耐受缺失和免疫調(diào)控紊亂為特點(diǎn)，以免疫復(fù)合物沉積、結(jié)締組織炎癥和血管病變?yōu)榛静±砀淖?。NETs作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞的一種區(qū)別于凋亡和壞死的細(xì)胞死亡形式，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是以DNA為基本骨架，上面附著有多種蛋白酶和抗菌肽[9]?；贜ETs獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，首先被發(fā)現(xiàn)在殺滅入侵的病原體方面具有重要作用，隨后研究發(fā)現(xiàn)其可作為自身抗原而參與SLE發(fā)病[10-11]。故可通過(guò)研究NETs形成的分子機(jī)制找到其關(guān)鍵信號(hào)分子，從而減少機(jī)體內(nèi)NETs形成，為SLE的防治提供依據(jù)。

近年來(lái)，關(guān)于NETs形成相關(guān)分子機(jī)制研究已有報(bào)道，當(dāng)抑制TAK1、p38 MAPK及MEK通路后中性粒細(xì)胞形成的胞外染色質(zhì)細(xì)絲短，且?guī)缀鯖](méi)有相互連接，但對(duì)染色質(zhì)的釋放影響較小，從而調(diào)控了NETs的早期形成，而Syk和PI3K蛋白抑制劑處理中性粒細(xì)胞后，幾乎沒(méi)有染色質(zhì)排出，表明其參與了NETs的后期形成過(guò)程[12]。有學(xué)者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了相關(guān)靶點(diǎn)藥物，Yao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑ONO-5046能通過(guò)抑制ROS產(chǎn)生而減少LPS誘導(dǎo)的NETs形成，從而減輕炎癥癥狀，此外，丙泊酚也可通過(guò)抑制p-ERK和HOCl產(chǎn)生而減少PMA誘導(dǎo)的NETs形成[14]。故研究參與NETs形成的信號(hào)通路對(duì)疾病治療藥物的研發(fā)有重要意義。

21世紀(jì)初有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NETs參與了SLE的發(fā)病過(guò)程，本小組前期研究也發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中性粒細(xì)胞NETs形成增強(qiáng)，并可能與疾病的活動(dòng)度相關(guān)[15]，但SLE患者體內(nèi)NETs過(guò)度形成的分子機(jī)制仍不清。PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活等，其異常活化不僅參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還能通過(guò)導(dǎo)致胰島素抵抗及影響骨骼肌、脂肪組織、肝臟、大腦等組織器官的作用而參與肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病過(guò)程[4,16]。此外，還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)脂多糖(LPS)可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路而促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬作用[17]，LPS是可刺激NETs形成的誘導(dǎo)劑，那么此過(guò)程也可能是LPS通過(guò)促進(jìn)中性粒細(xì)胞形成NETs而達(dá)到增強(qiáng)其吞噬的功能。此外，PI3K/Akt也是經(jīng)典的抗凋亡通路蛋白，而NETs作為中性粒細(xì)胞的一種異于凋亡的細(xì)胞死亡形式，抗凋亡蛋白PI3K/Akt是否參與了這一過(guò)程？據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在NETs經(jīng)典強(qiáng)效誘導(dǎo)劑—PMA的作用下，PI3K/Akt特異性抑制劑—LY294002/MK2206均可減少PMA刺激形成的NETs，表明在NETs形成過(guò)程中有PI3K/Akt活化的參與。此外，還有研究[18]發(fā)現(xiàn)，SLE混合血清因含有大量炎性因子和自身抗體而可作為誘導(dǎo)PMN形成NETs的生理誘導(dǎo)劑，但參與其中的分子機(jī)制不明。本研究進(jìn)一步探究了PI3K/Akt在SLE混合血清刺激PMN形成NETs中的作用，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt特異性抑制劑通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)蛋白的活化而參與SLE混合血清誘導(dǎo)的NETs形成。我們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入Akt抑制劑后，PMN自發(fā)形成的NETs水平降低，但PI3K特異性抑制劑無(wú)此作用，表明PMN在自發(fā)形成NETs過(guò)程中有Akt的活化，但仍需進(jìn)一步分析其上游調(diào)節(jié)蛋白。

綜上所述，PI3K/Akt抑制劑能抑制PMA及SLE混合血清刺激PMN形成NETs，故推測(cè)PI3K/Akt參與了SLE患者體內(nèi)NETs的形成。但PI3K/Akt在SLE患者體內(nèi)NETs形成中的作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其能否作為靶點(diǎn)藥物還需進(jìn)一步探索。