喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油成分分析及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

祁悅，梅文莉，王雅麗，陳惠琴，戴好富，*，黃圣卓，*

（1.海南大學(xué)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室，海南 ?？?571101）

全世界有記載的姜科（zingiberaceae）植物約有52屬，1 300多種，主要分布于熱帶、亞熱帶和非洲地區(qū)，我國有21屬，230多種，主要產(chǎn)于我國華南及西南等熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。姜科植物富含揮發(fā)油和二苯基庚烷類成分，其中大多數(shù)具有藥用和食用價值，許多種類具有悠久的藥用歷史[2]。目前2020年版《中華人民共和國藥典》收載的姜科植物有姜黃、莪術(shù)、郁金和益智等12種[3]，收入《中國藥用植物志》的姜科植物有15屬，95種之多[4]。民間食用和藥用的姜科植物草藥則更多。其中喙花姜（Rhynchanthus beesianus W.W.Smith）又名滇高良姜、喙姜花、巖姜，是姜科喙花姜屬（Rhynchanthus）植物，株高0.5 m～1.5 m，花型獨特，是藥用、觀賞、食用植物，其塊莖部分有芳香氣味[5-6]。該屬植物在中國僅分布喙花姜一種，產(chǎn)于云南省，在緬甸亦有分布，生長于海拔1 500 m～1 900 m的疏林、灌叢或草地上，目前人工栽培較少。其在中國云南西雙版納和瑞麗等部分地區(qū)，替代高良姜和姜作為食用調(diào)料，食用部分為植物塊莖和根，具有除臭矯味，遮蓋牛羊肉的異味，形成菜肴獨特風(fēng)格等效果。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，喙花姜塊莖的精油具有良好的抑菌和殺菌活性[7]，具有作為食品、香料以及醫(yī)用的開發(fā)利用價值[8-9]。但對其芳香物質(zhì)基礎(chǔ)的研究仍少有報道，其香味化學(xué)性質(zhì)和安全性缺乏科學(xué)證據(jù)，限制了喙花姜的開發(fā)利用。為了了解喙花姜的香味物質(zhì)基礎(chǔ)，研究其化學(xué)成分安全性，本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析了喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油的化學(xué)成分，檢索分析其主要成分的哺乳動物消化道吸收能力和毒性，驗證其作為功能性食品的開發(fā)潛力。在此基礎(chǔ)之上，對喙花姜塊莖和根的揮發(fā)油進(jìn)行α-葡萄糖糖苷酶抑制活性試驗，以期了解此植物的降血糖活性，為喙花姜的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喙花姜植物樣品于2018年被引種到?？?，經(jīng)海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室黃圣卓博士鑒定為喙花姜（Rhynchanthus beesianus W.W.Smith），經(jīng)過馴化栽培，2020年8月15日取樣，喙花姜標(biāo)本（HUANG00054）保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所天然產(chǎn)物化學(xué)研究室。

4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（4-nitrophenylβ-D-galactoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶：西格瑪公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：天津富宇精細(xì)化工有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：北京欣經(jīng)科公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EN2062電子秤:上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司；98-1-B電熱套:天津泰斯特儀器有限公司；7820A-5977E型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：英國RS Biotech公司；ELX-800型酶標(biāo)儀：美國寶特公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 揮發(fā)油提取流程

將植物樣品喙花姜塊莖和根分別切碎，稱取新鮮切碎的塊莖488 g，根222 g，分別放入2 L圓底燒瓶中并加入1 L蒸餾水，然后用水蒸氣蒸餾法提取10 h，直到揮發(fā)油量不再增加，之后分別收集喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油。得到塊莖和根中的揮發(fā)油分別為0.54 g和0.31 g，根據(jù)下式計算提取率，分別為0.11%和0.14%。分別取提取好的喙花姜塊莖和根揮發(fā)油2.6 mg和3.8 mg，置于離心管內(nèi)，為后續(xù)α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗備用。

1.3.2 GC-MS分析條件

1.3.2.1 GC條件

色譜柱：HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣條件：高純氦氣（99.999%）；升溫程序：柱溫50℃，以5℃/min升溫至310℃，保持 10 min；載氣流量：1.0 mL/min；柱前壓為43 kPa；進(jìn)樣量為1 μL；不分流進(jìn)樣，溶劑延遲時間4.0 min。

1.3.2.2 MS條件

電子轟擊離子源；電子能量為70 eV；發(fā)射電流為34.6 μA；離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；倍增器電壓為1 718 kV；接口溫度為250℃；質(zhì)量范圍是40 m/z～800 m/z。

1.3.3 主要化合物的安全性分析

通過化學(xué)成分毒性檢索網(wǎng)站（https://www.chemsrc.com/），分析喙花姜塊莖和根的揮發(fā)油中相對含量超過1%的21個化合物的安全性。主要參考其logP的數(shù)值（部分未檢索到試驗數(shù)據(jù)，通過chemoffice軟件模擬）和經(jīng)大鼠口服的LD50數(shù)值。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

配制 PBS溶液（0.1 mol/L，pH6.8），α-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/L），配制陽性對照阿卡波糖溶液（用DMSO溶解為終濃度1.06 mg/mL），梯度稀釋6個濃度備用。配制PNPG（0.752 5 mg/mL）和配制待測樣品，分別取喙花姜塊莖精油2.6 mg，喙花姜根精油3.8 mg用DMSO溶解成3 mg/mL。取450 μL配制好的α-葡萄糖苷酶溶液用pH6.8的PBS溶液稀釋于EP管中，取45μL待測樣品加至EP管中，搖勻，分別取4次110 μL混合均勻的待測溶液于96孔板中。（陰性組與空白組：取450 μL配制好的α-葡萄糖苷酶溶液于EP管中，再取45 μL的DMSO溶液加至EP管中，搖勻，分別取4次110 μL混合均勻的待測溶液于96孔板中）

將96孔板放入37℃的恒溫箱反應(yīng)15 min，然后各組均加入40 μL的底物PNPG，空白：加入40 μL PBS溶液。將96孔板于37℃放置15 min后取出。將酶標(biāo)儀調(diào)至405 nm波長，使用酶標(biāo)儀測量每孔的OD值。測定各孔吸光度并計算抑制率，計算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油成分分析

在Data Analysis化學(xué)工作站對總離子流圖中的各色譜峰進(jìn)行MS掃描后，檢索與比對圖譜庫NIST2014和Wiley275，鑒定喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油的化學(xué)成分。運用峰面積歸一化法計算各化學(xué)成分的相對含量。喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油成分總離子流圖如圖1和圖2所示，鑒定的化學(xué)成分如表1所示。

表1 喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油化學(xué)成分及其相對含量Table 1 Chemical constituents and relative content of the volatile oil from the tubers and roots of R.beesianus

圖1 喙花姜塊莖揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile oil from Rhynchanthus beesianus tubers

圖2 喙花姜根揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile oil from R.beesianus roots

通過圖1、圖2中喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油總離子流圖對比發(fā)現(xiàn)，在保留時間0～10 min內(nèi)的離子流和峰面積差異不明顯，在保留時間10 min～20 min內(nèi)，根揮發(fā)油的離子流強度和峰面積均較大，在保留時間20 min～30 min內(nèi)，塊莖揮發(fā)油的離子流峰強度和面積均較大；峰最高強度和峰面積最大值均出現(xiàn)在保留時間7 min左右，其化學(xué)成分為桉油精。保留時間在4 min～17min的化合物主要為單萜類成分，保留時間在17min～30 min的化合物主要為倍半萜類成分。兩種揮發(fā)油中鑒定出的化合物的總相對含量分別達(dá)到了98.92%和96.98%，較為充分地實現(xiàn)了分析兩種揮發(fā)油的目的。

由表1可知，從喙花姜塊莖和根的揮發(fā)油中分別鑒定出27個和32個化學(xué)成分，其相對含量總和占比分別為98.92%和96.98%，保留時間在4 min～17 min的化合物主要為單萜類成分，保留時間在17 min～30 min的化合物主要為倍半萜類成分，其中桉油精為兩種揮發(fā)油的主要成分，相對含量分別為48.81%和37.23%。在喙花姜塊莖的揮發(fā)油中，相對含量超過1%的化學(xué)成分有12個，主要為單萜和倍半萜類；相對含量超過5%的化學(xué)成分有3個，分別為桉油精（48.81%）、β-桉葉油醇（16.00%）和γ-桉葉油醇（5.04%）。在喙花姜根的揮發(fā)油中，相對含量超過1%的化學(xué)成分有16個，主要為單萜和倍半萜類；相對含量超過5%的成分有4個，分別為桉油精（37.23%）、β-蒎烯（8.35%）、甲酸龍腦酯（7.05%）和γ-松油烯（6.26%）。兩種揮發(fā)油中有20個相同的化學(xué)成分，只在塊莖中含有的化學(xué)成分有二環(huán)大根香葉烯和δ-畢澄茄烯、愈創(chuàng)醇等7個；只在根中含有的化學(xué)成分有α-松油烯、對傘花烴和甲酸龍腦酯等12個。通過GC-MS分析可知，喙花姜塊莖和根的揮發(fā)油中成分均主要為單萜和倍半萜，塊莖中單萜類總相對含量為65.03%，倍半萜類總相對含量為31.76%；根中單萜類總相對含量為78.74%，倍半萜類總相對含量為16.99%；桉油精在兩種揮發(fā)油中的相對含量均最高（48.81%和37.23%）；單萜均為其塊莖和根中揮發(fā)油的主要成分類型。

2.2 主要化合物的安全性

對21個主要化合物的化學(xué)成分進(jìn)行毒性檢索，主要參考其logP的數(shù)值和經(jīng)大鼠口服的LD50數(shù)值，分析喙花姜塊莖和根中主要化合物的安全性。

有機化合物的脂水分配系數(shù)（P）通常是指化合物在正辛醇和水兩相間的分配系數(shù)，以其對數(shù)值來表示其大小，標(biāo)記為logP，用于研究有機化合物在生物體內(nèi)以及環(huán)境中的遷移行為[10]。一般情況下，小于0代表強親水性藥物，吸收不好；0到3，吸收好；大于3代表強親脂性藥物，吸收不好；大于5會有嚴(yán)重吸收問題，需要考慮增加藥物溶解性能來增加吸收。部分化合物安全性分析見表2。

表2 主要化學(xué)成分安全性分析Table 2 Safety analysis of main chemical compounds

由表 2 可知，桉油精的 logP 為 2.82，（+）-龍腦、4-萜烯醇、α-松油醇、左旋乙酸龍腦酯、甲基丁香酚、約在logP值為2左右，其余15個化合物logP＞3。說明表2中大多數(shù)化合物并不能被人體很好的吸收，因此安全性較好。通過檢索化合物口服LD50發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)主要成分能夠查到相關(guān)試驗結(jié)果，且均超過800 mg/kg，遠(yuǎn)超正常攝入量，可見安全性均較好。

通過對喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油的主要化學(xué)成分進(jìn)行檢索分析，發(fā)現(xiàn)其主要化學(xué)成分均為常見的香料成分，通過分析其人體吸收能力和毒性可以初步判斷其生物安全性和初步證實其作為食品或香料的安全性。桉油精、α-蒎烯、β-石竹烯和莰烯等化合物是精油中的主要成分，是安全無毒的香味物質(zhì)，常被應(yīng)用于日化產(chǎn)品的生產(chǎn)[11]。主要成分桉油精主要用作藥草型香精，用于配制精油、牙粉牙膏、口腔清涼劑和藥皂等，也較多用于醫(yī)藥，具有解熱、消炎、抗菌、防腐、平喘及鎮(zhèn)痛作用[12]。高良姜（Alpinia officinarum Hance.）為姜科山姜屬的一種重要藥食兩用中藥，其干燥根莖可用作治療胃痛、緩解感冒、促進(jìn)循環(huán)系統(tǒng)、治療嘔吐和消腫，還因具有抗菌、抗病毒等功效而被廣泛研究[13-14]，也是一種深受人們喜愛的調(diào)味品，高良姜揮發(fā)油中主要成分也同樣為桉油精，相對含量較高的化合物有桉油精、δ-畢澄茄烯、α-松油醇、β-蒎烯、α-蒎烯、莰烯等[15-17]；喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油化學(xué)成分與高良姜具有很好的相似性，驗證了其替代高良姜使用的合理性，兩者均可成為食品或日化用香料香精產(chǎn)品的一個重要來源。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性結(jié)果與分析

α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結(jié)果見表3所示。

表3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結(jié)果Table 3 Results of α-glucosidase inhibitory activity test

由表3可以看出，初篩時發(fā)現(xiàn)喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，其抑制率分別達(dá)到73.5%和89.1%，效果優(yōu)于陽性對照。后檢測其 IC50值，分別為 127.5 μg/mL 和 73.4 μg/mL，低于陽性對照阿卡波糖456.6 μg/mL。表明喙花姜塊莖和根中一些成分具有一定的降血糖活性。α-葡萄糖苷酶主要存在于小腸黏膜細(xì)胞，其功能為水解低聚糖以便于人體吸收利用。而其抑制劑通過抑制其活性，降低低聚糖水解速率從而降低血糖水平，防止飯后出現(xiàn)高血糖的現(xiàn)象[18]，這對于治療和緩解糖尿病及并發(fā)癥有重要作用。

3 結(jié)論

通過GC-MS分析可知，喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油中成分均主要為單萜和倍半萜，其含量最高的化合物為桉油精，是常見的香料成分。通過對主要成分的logP和LD50值檢索，分析了其作為食品的安全性。此外，利用PNPG法對喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制活性的測試。目前用于臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用較多的抑制劑有阿卡波糖、伏格列波糖等，對人體有一定的毒副作用[19]。從植物中提取能夠抑制α-葡萄糖苷酶的物質(zhì)，對尋找安全有效的降血糖藥物至關(guān)重要。結(jié)果表明，喙花姜塊莖和根中揮發(fā)油表現(xiàn)出一定的降血糖活性，在一定程度上證明了喙花姜降血糖方面的價值，證明喙花姜在降血糖活性應(yīng)用方面與高良姜（Alpinia officinarum）類似[20]，未來亦可以作為降血糖藥物或保健食品進(jìn)行開發(fā)與利用。