包裝保存方式對(duì)陳舊生物檢材STR 檢驗(yàn)的影響

楊電 帥軍云 胡慧英

（1.廣州市公安局，廣東 廣州 510030；（2.廣州市公安局黃埔分局，廣東 廣州510000）

對(duì)于法醫(yī)生物檢材的包裝保存方法，法醫(yī)學(xué)教科書和公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《法醫(yī)生物檢材的提取、保存、送檢規(guī)范》均提出斑跡類生物檢材宜晾干后放置在透氣紙質(zhì)物證袋中陰涼干燥處保存或冷藏保存［1］。但在實(shí)際工作中，很多斑跡類生物檢材都是放常溫保存，難以做到冷藏保存。近年來由于積案攻堅(jiān)，許多保存數(shù)年甚至數(shù)十年的案件生物檢材被要求重新進(jìn)行STR 檢驗(yàn)。本文對(duì)近5 年來檢驗(yàn)的保存時(shí)間10年以上的59 宗案件149 份包括血痕、唾液斑（包括口腔拭子、煙蒂）、精斑、接觸細(xì)胞類等斑跡生物檢材的STR檢驗(yàn)情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料與方法

1.1 樣本

廣州市公安司法鑒定中心2015～2020 年檢驗(yàn)的常溫保存時(shí)間10 年以上的59 宗案件149 份斑跡生物檢材（見表1），包括血痕、唾液斑（包括口腔拭子、煙蒂）、精斑、接觸細(xì)胞類檢材等。這些檢材有19 份用紙質(zhì)物證袋包裝后放電子除濕干燥柜保存；94 份先用紙袋包裝再放塑料袋密封保存或直接用塑料袋包裝保存；36份只用紙質(zhì)物證袋包裝保存。149 份生物檢材中61 份檢材為案發(fā)當(dāng)時(shí)檢驗(yàn)過，現(xiàn)在要求復(fù)核和加做基因座，88份檢材未檢驗(yàn)過。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

（1）血痕、煙蒂、口腔拭子、脫落細(xì)胞檢材等：取適量檢材于離心管或帶提藍(lán)的離心套管中，加入FW-超微量磁珠法DNA 提取試劑盒（長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司）的裂解液FW 300μL 56℃保溫 2h 后 95℃ 10min，12000rpm 離心3min。將裂解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到試劑條的A→B→C孔中，每孔100μL，同時(shí)向洗脫孔（H）中加入30～60μL 洗脫液。將加好液的試劑條板架和塑料磁套裝載在KingFisher 核酸純化儀（長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司）中的指定位置，選擇FW300_H程序運(yùn)行。

（2）精液陰道液混合斑：剪取10mm×10mm左右可疑斑跡，加入500μL TNE 浸泡約30min，期間振蕩數(shù)次，10000rpm 離心1min，取上清100μL 用人精液PSA 金標(biāo)試劑條（北京芬格爾安科技有限公司）進(jìn)行精斑確證試驗(yàn)。管中再加入 50μL 10% SDS，10μL 20mg/mL 蛋白酶 K（美國(guó)QIAGEN 公司），混勻后置37℃保溫5h 以上，采用套管10000rpm離心5min去除載體，吸取上清200μL 轉(zhuǎn)移至另外離心管中，加入500μL配制的裂解液（Lysis：1M DTT為100∶1，美國(guó)Promega 公司） 震蕩混勻，按文獻(xiàn)采用DNA IQ Casework Sample試劑盒（Promega公司，美國(guó)） 在Maxwell? 16 自動(dòng)儀 （Promega 公司，美國(guó)）平臺(tái)上提取女性DNA，洗脫液60μL。吸棄剩余的上清，沉淀用500μL TNE 洗2 次，然后將沉淀加入500μL 配制的裂解液震蕩混勻，95℃保溫10min，吸出液體按文獻(xiàn)［2］提取DNA，洗脫液30～60μL。

1.2.2 STR擴(kuò)增及其分型

常染色體STR 檢驗(yàn)用PowerPlex?21 System Kit（美國(guó)Promega 公司）試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，Y 染色體STR 檢驗(yàn)采用 Yfiler?Plus（美國(guó)AB 公司）或AGCU Y37、AGCU YSUPP Plus 試劑盒（中德美聯(lián)公司）擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為10～15μL，模板用量為6～9μL，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為30～32 個(gè)循環(huán)。在AB 3130xl或3500xl遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T1163-2014《人類DNA 熒光標(biāo)記STR 分型結(jié)果的分析及應(yīng)用》規(guī)定，兩個(gè)檢材不少于13 個(gè)STR 基因座的基因型相同時(shí)才能判斷為匹配，因此檢材以獲得性別及13 個(gè)以上STR 基因座的明確分型為有效檢出，并分析擴(kuò)增效果。

2 結(jié)果

149 份常溫保存的斑跡生物檢材總體情況如表1 所示。其中78 份血痕檢材，30 份用紗布、濾紙或棉簽轉(zhuǎn)移的血痕用透氣紙質(zhì)物證袋包裝后放紙箱或開放的貨架上保存，檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)顏色變暗或變成銹黃色，提取DNA 進(jìn)行STR檢驗(yàn)均未檢出有效STR 分型（見圖1）。38 份血痕，其中18 份用紗布、濾紙或棉簽轉(zhuǎn)移的血痕，20 份附著在鑰匙、刀具、磚頭、棍棒、衣物、紙張等載體上的血痕，用透氣紙袋包裝后用塑料袋保存或直接用塑料袋保存，檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)血痕顏色變暗紅。除4 份用濾紙或棉簽轉(zhuǎn)移的血痕未檢出有效STR 分型外，34 份血痕均成功檢出有效STR 分型，特別是附著在載體上保存的血痕基本上都能檢出全部基因型，但出現(xiàn)提示降解的坡形峰（見圖2）。10 份用干燥柜保存的血痕顏色也變暗紅，有6 份用紗布或棉簽轉(zhuǎn)移，4 份為附在載體上的血痕，提取的DNA均檢出全部基因型，且坡形峰現(xiàn)象不明顯（見圖3）。3 種檢材保存方式對(duì)血痕STR 檢出效果的影響（見表2）。

表1 149份常溫保存的斑跡生物檢材總體情況

表2 3種檢材保存方式對(duì)血痕STR檢出效果的影響

圖1 16年前用紙袋保存的血痕及STR分型結(jié)果

圖2 20年前用塑料袋保存的內(nèi)褲上血痕及STR分型結(jié)果

圖3 干燥柜保存的20年前血痕及STR分型結(jié)果

22 份唾液斑檢材，有6 份唾液紗布和口腔棉簽只用紙袋保存，提取DNA 均未檢出STR 分型。塑料袋保存的10 份唾液斑檢材除1 枚煙蒂和2 個(gè)口腔棉簽提取的DNA 未檢出有效STR 分型外，其它5枚煙蒂和2個(gè)口腔棉簽均成功檢出有效STR 分型，但有不同程度的坡形峰甚至丟峰現(xiàn)象。干燥柜保存的6 枚煙蒂則成功檢出全部基因型（見表3）。

表3 3種檢材保存方式對(duì)唾液斑STR檢出效果的影響

7 份精斑檢材均為陰道液精液混合斑，包括5 份陰道拭子和1 份衣物上精斑、1 份衛(wèi)生紙上精斑。4 份塑料袋保存的精斑均成功檢出精子有效的STR 分型，但有不同程度的坡形峰甚至丟峰現(xiàn)象。3 份干燥柜紙袋保存的精斑均成功檢出精子的全部基因型，且峰高均衡（見表4）。

表4 3種檢材保存方式對(duì)精斑檢材STR檢出效果的影響

由于當(dāng)時(shí)檢驗(yàn)條件的限制，10 多年前很多案件沒有檢驗(yàn)接觸DNA，這些接觸細(xì)胞檢材只作為普通物證原物用塑料袋包裝后放在物證室。近幾年為破積案，這些檢材被翻出來要求檢驗(yàn)。送檢的42 份可疑接觸細(xì)胞檢材，包括懷疑為做案工具的磚頭、刀具、繩索、指甲內(nèi)容物等，有21 份檢出有效STR 分型，但有不同程度的坡形峰甚至丟峰現(xiàn)象（見圖4）。

圖4 塑料袋保存的17年前鐵錘及錘柄擦拭物STR分型結(jié)果

3 討論

本文對(duì)59 宗積案149 份斑跡生物檢材的STR 檢驗(yàn)效果分析表明，生物檢材的保存方法相比保存時(shí)間對(duì)STR 檢驗(yàn)成敗更為重要，這和路鏡玉等人［3］的觀點(diǎn)相似。南方地區(qū)大部分時(shí)間處于高溫潮濕環(huán)境，干燥的生物檢材保存在透氣紙袋中在梅雨季節(jié)往往因反復(fù)吸潮而發(fā)霉腐敗，導(dǎo)致DNA 降解無法檢出STR 分型；而檢材干燥后保存在塑料袋中因?yàn)楦艚^了水分、空氣，反而不容易霉變降解，因此可能成功檢驗(yàn)STR；干燥柜保存的檢材干燥效果最佳，STR檢驗(yàn)效果基本不受影響。對(duì)10 年以上積案檢材的檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同一案件中，當(dāng)事人的血樣或口腔拭子、現(xiàn)場(chǎng)轉(zhuǎn)移血痕、煙蒂等因長(zhǎng)期保存在紙質(zhì)物證袋中導(dǎo)致STR 檢驗(yàn)失敗，而附在做案工具或物品上的血痕、唾液斑、接觸細(xì)胞、精斑等檢材因用塑料袋包裝保存卻能成功檢出STR基因型。特別是口腔拭子、煙蒂等唾液斑檢材，保存在紙袋中經(jīng)常不到5 年就難以檢出有效STR 分型，但保存在塑料袋中十多年都可能成功檢出。如2004 年1 例命案，嫌疑人在現(xiàn)場(chǎng)留下了3個(gè)煙蒂，當(dāng)時(shí)提取檢驗(yàn)后用塑料袋常溫保存，2020 年復(fù)檢時(shí)，1枚煙蒂檢驗(yàn)多個(gè)國(guó)產(chǎn)試劑盒均能檢出全部基因型，另2枚煙蒂檢驗(yàn)時(shí)也只發(fā)生部分等位基因丟失現(xiàn)象。用塑料袋保存的94 份血痕、唾液斑、接觸細(xì)胞等檢材有27 份未檢出有效STR 分型，這些檢材保存的年限并不是最長(zhǎng)的，如4 份轉(zhuǎn)移血痕保存時(shí)間均不超過12 年就無法有效檢出，有些轉(zhuǎn)移血痕在同樣的環(huán)境下保存時(shí)間超過16 年也能檢出全部基因型，分析原因可能是檢材未完全晾干就放入塑料袋保存，塑料袋沒有很好封口或者檢材細(xì)胞量太少。

因?yàn)閷?shí)踐中發(fā)現(xiàn)潮濕的天氣對(duì)生物檢材保存的破壞性，有些分局購(gòu)買了電子式干燥柜來保存生物檢材。電子式干燥柜是利用高效吸濕材料的吸濕性能來進(jìn)行柜內(nèi)濕氣的抽濕，在柜內(nèi)吸收濕氣之后，對(duì)材料進(jìn)行加熱，從而將濕氣氣化，通過葉門直接排至柜外，以此維持柜內(nèi)物品的干燥。實(shí)驗(yàn)表明，19 份紙袋包裝保存在干燥柜10 多年的血痕、唾液斑、精斑等檢材的STR 檢驗(yàn)效果和新鮮檢材類似，不僅能檢出全部基因型，而且峰高均衡。因?yàn)楦稍锕袢萘康脑颍@些單位在干燥柜太滿時(shí)會(huì)將放置比較久的檢材取出用塑料自封袋封好或用塑料袋抽真空包裝常溫保存。該19 份干燥柜保存的檢材中有5 份是2000～2004 年的檢材，3年前取出后用塑料自封袋封好保存，今年檢驗(yàn)多個(gè)國(guó)產(chǎn)試劑盒也能檢出峰高較均衡的全部基因型。

可見，斑跡生物檢材要實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期安全保存，保持干燥環(huán)境最關(guān)鍵。生物檢材置干燥柜內(nèi)保存干燥條件最好，STR 檢驗(yàn)效果也最佳，其次是檢材干燥后塑料袋保存，透氣紙袋保存不能保證檢材受環(huán)境濕度變化的影響，高溫潮濕環(huán)境長(zhǎng)期保存的斑跡生物檢材均無法檢出有效STR 分型。另外，有研究表明，紙質(zhì)物證袋包裝生物檢材，DNA 轉(zhuǎn)移到物證袋上的量顯著高于塑料袋包裝，可能影響到微量生物檢材的檢驗(yàn)［4］。其實(shí)，生物檢材的保存和食品的保存類似，水分和氧氣是影響安全保存的最重要因素，為延長(zhǎng)食品的保鮮，現(xiàn)代主要采用塑料袋加保鮮干燥劑密封或抽真空保存的方法。2012 年左右，本單位開始對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)采集的人員口腔拭子、血卡在檢驗(yàn)后抽真空干燥保存，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)斑跡檢材采用棉簽轉(zhuǎn)移后放置在帶干燥劑的塑料套管懸空保存［5］，原物提取的檢材干燥后放置在塑料自封袋內(nèi)保存，檢驗(yàn)后的檢材干燥后用塑料自封袋裝好再放置在塑料整理箱內(nèi)保管，減少了水分和氧氣對(duì)檢材的不利影響，因此2012 年以后的檢材復(fù)檢基本上都能獲得完整的STR 分型。綜上所述，法醫(yī)教科書和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)法醫(yī)生物檢材保存方法的規(guī)定有必要與時(shí)俱進(jìn)，借鑒這些有效做法進(jìn)行修改，讓生物檢材實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期安全保存。