基于網絡藥理學探討驅風止痛散治療急性痛風性關節(jié)炎的作用及其機制*

郭思彤，譚思濤，梁小玲，黃菊，劉麗敏△

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院藥學部，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021）

急性痛風性關節(jié)炎（AGA）是一種常見的炎性疾病，以高尿酸血癥和關節(jié)或/和組織內尿酸鈉（MSU）結晶為特征[1]。隨著生活方式和飲食結構的改變，導致全球范圍內痛風的發(fā)病率逐年上升[2]。目前痛風并無治愈方法，臨床治療主要以緩解癥狀和預防復發(fā)為主，常用藥物有秋水仙堿、糖皮質激素、別嘌呤醇和苯溴馬隆等[3]。以上藥物雖在控制癥狀方面有效，但存在副作用較大且停藥后易復發(fā)等問題[4]。因此，迫切需要開發(fā)更有效、副作用更小的治療痛風藥物。

我國中醫(yī)理論認為痛風是由濕熱內蘊、血阻氣機、氣滯血瘀所致。驅風止痛散（QFZTS）由腎茶（Clerodendranthus spicatus）、車前草（Plantaginis Herba）、牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）、蒼術（Atractylodis Rhizoma）和菟絲子（Cuscuta chinensis）組成，在民間常用于痛風的治療。方中以腎茶為君藥，功能清熱去濕，排石利尿；車前草利尿、除濕、清熱、涼血，牛膝生用活血通經，熟用可補肝腎，強腰膝，菟絲子滋補肝腎、固精縮尿，三者輔助君藥清熱祛濕、活血通經，共為臣藥；蒼術可燥濕、化濁、止痛，用作佐藥。諸藥配伍應用，共奏利水消腫、滋補肝腎、強筋健骨、消腫止痛之功效，但其作用機制尚不明確[5-9]。本研究通過網絡藥理學方法系統分析QFZTS治療AGA的藥物靶點和關鍵通路，并通過構建大鼠AGA模型探討QFZTS對AGA的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 QFZTS活性成分及其相關靶點的篩選 采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索QFZTS相關的所有化學成分，根據藥物動力學和毒理學，選取口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為初篩參數，再將篩選后得到的化合物成分經過Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）比對，檢索文獻補充已驗證靶點，最終獲取QFZTS活性成分的基因靶點。

1.2 AGA潛在靶標的獲取 分別以OMIM數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、GeneCards數據庫（https://www.genecards.org）挖掘AGA相關基因，將2個數據庫檢索的結果進行整合，刪除重復項后得到AGA的相關靶點。將得到的疾病靶點與藥物靶點取交集，獲取其二者的共同靶點基因，為QFZTS作用于AGA的潛在靶點。

1.3靶點蛋白互作網絡與可視化網絡的構建與分析 將疾病靶點與藥物靶點取交集提交至STRING11.0數據庫（https://string-db.org）構建蛋白—蛋白相互作用（PPI）網絡模型[10]，設定生物物種為人類，最低相互作用閾值取最高“highest confidence（≥0.9）”，其余設置均為默認設置，得到PPI網絡，并通過CytoScape3.7.1中的hubba插件對PPI網絡進一步分析篩選度值最佳的前20個靶點，得到潛在的關鍵靶點基因，并通過分析其參與的生物學進程對其功能進行描述。

1.4 QFZTS治療AGA的基因本體及通路富集分析 為了分析和獲得目的基因的主要功能和通路富集，采用Cytoscape軟件的ClueGO插件，對QFZTS治療AGA的靶點關聯KEGG數據庫中的信號通路，分析QFZTS治療AGA的通路。

1.5實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體重180～220 g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（桂）2020-0002。本研究動物實驗及處置嚴格按照動物倫理學要求進行。

1.6藥物和試劑QFZTS（廣西壯藥方醫(yī)院，批號：20180908）；秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)公司，批準號：H53021369）、MSU（Aladdin公司，批 號：20211113）。白介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、轉化生長因子（TGF）-β1酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（江萊生物）；RNAiso Plus、RNA逆轉錄及定量擴增試劑盒（寶日醫(yī)生物技術有限公司）。

1.7實驗分組和造模將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、秋水仙堿組（6×10-4 g/kg）及QFZTS高、中、低劑量組（6.4 g/kg、3.2 g/kg、1.6 g/kg），每組10只。適應性喂養(yǎng)7 d后，按照體重分別灌胃給予不同濃度的QFZTS、秋水仙堿和蒸餾水（模型組），1次/d，連續(xù)給藥7 d。給藥第4天，使用滅菌注射器將MSU混懸液（25 mg/mL）注入踝關節(jié)腔內，以關節(jié)囊對側鼓起為標準，誘導AGA模型，空白組關節(jié)腔內注入生理鹽水[11]。

1.8血清炎癥因子含量測定 造模72 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，腹主動脈采血，離心，取上清。采用ELISA法檢測大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平。

1.9踝關節(jié)滑膜組織病理學觀察10%福爾馬林溶液固定大鼠關節(jié)，EDTA脫鈣液脫鈣，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋、切片，行HE染色，光學顯微鏡下觀察踝關節(jié)滑膜組織病理學變化。

1.10 RT-qPCR法檢測炎性小體（NLRP3）、Caspase-1、IL-1β mRNA表達 取踝關節(jié)周圍軟組織，提取總RNA，BCA法測定濃度，逆轉錄合成cDNA，行PCR反應。PCR反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火、延伸31 s，共40個循環(huán)。引物由由寶工公司設計并合成，引物序列如下，IL-1β上游：5’-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3’，下游：5’-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3’；Caspase-1上游：5’-GACCGAGTGGTTCCCTCAAG-3’，下游：5’-GACGTGTACGAGTGGGTGTT-3’；NLRP3上游：5’-GCTGTGTGAGGCACTCCAG-3’，下游：5’-GAAACAGCATTGATGGGTCA-3’；GAPDH上游：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。以GAPDH作為內參基因，采用2-△△CT計算目的基因相對表達量[12]。

1.11統計學方法用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 QFZTS藥物靶點 通過TCMSP數據庫篩選腎茶、車前草、牛膝、蒼術、菟絲子，潛在的活性化合物，結合化學專業(yè)數據庫，補充有效成分及其靶點，得到QFZTS有效成分45個及其對應靶點254個。

2.2 AGA疾病靶點 通過GeneCards數據庫檢索“Acute Gouty Arthritis”，設定相關性分數＞3，并通過檢索OMIM數據庫補充獲得AGA疾病相關靶點192個。

2.3 QFZTS治療AGA的PPI網絡構建及靶點篩選

通過將QFZTS藥物靶點與AGA疾病靶點交集信息（圖1A）導入STRING數據庫，設定生物物種為人類，構建PPI網絡，發(fā)現其產生直接及間接作用的基因33個，靶點與靶點相互關系247個，見圖1B。用Cytoscape軟件的hubba功能篩選PPI網絡得到QFZTS治療AGA相關度最高的前20個基因靶點，包括絲裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）、基質金屬蛋白酶3（MMP3）、白介素-8（CXCL8）、C反應蛋白（CRP）、一氧化氮合酶2（NOS2）、IL-1β、NLRP3、胱天蛋白酶1（CASP1）、過氧化物酶體增殖激活受體-γ（PPARG）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、IL-6、纖溶酶原激活物抑制因子1（SERPINE1）、淀粉樣β 前體蛋白（APP）、TNF、血紅素加氧酶1（HMOX1）、核轉錄因子p65（RELA）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、TGF-β1、趨化因子2（CCL2），見圖1C。

圖1 QFZTS-AGA基因靶點匹配

2.4 KEGG通路分析 采用Cytoscape軟件的ClueGO插件對QFZTS治療AGA的靶點進行KEGG數據庫通路分析，結果顯示：QFZTS治療AGA可影響腫瘤、炎癥免疫反應和氧化還原反應，具體與IL-17、糖基化終末期受體（AGE-RAGE）、TNF、核苷酸結合寡聚域受體（NOD）和核因子（NF）-κB等相關信號通路，見圖2A。對QFZTS治療AGA的相關靶點進行信號通路分析，并對結果可視化，見圖2B。

圖2 關鍵靶點和通路富集分析

2.5各組大鼠血清炎癥因子水平比較 與空白組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1含量升高；與模型組比較，秋水仙堿組及QFZTS高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1含量下降，QFZTS中劑量組IL-6、TNF-α 水平降低，QFZTS低劑量組IL-6含量降低，見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較 pg/mL，，n=10

表1 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較 pg/mL，，n=10

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.6踝關節(jié)滑膜組織切片病理組織結果 空白組踝關節(jié)滑膜組織完整，上皮細胞排列緊密整齊，未見異常炎癥細胞；模型組踝關節(jié)滑膜組織增生，滑膜中有大量炎性細胞浸潤；秋水仙堿組炎癥細胞和組織增生減少；QFZTS各劑量組滑膜增生情況均有不同程度的改善，炎性細胞浸潤減少，軟骨侵蝕性損傷減輕，見圖3。

圖3 大鼠踝關節(jié)滑膜組織病理變化（HE，×200）

2.7各組踝關節(jié)周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達比較 與空白組比較，模型組踝關節(jié)周圍軟組織NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達上調；與模型組比較，秋水仙堿組及QFZTS高、中劑量組NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達下調，見表2。

表2 各組踝關節(jié)周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較 ，n=10

表2 各組踝關節(jié)周圍軟組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA表達比較 ，n=10

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

3 討論

隨著生物信息學的快速發(fā)展，網絡藥理學已被證明是探索中醫(yī)藥的有力工具，能提供對藥物作用和疾病復雜性的系統理解和藥理學模型，有助于剖析中草藥對特定疾病的作用[13]。本研究成功構建了QFZTS與AGA的中藥復方靶點—疾病靶點網絡，通過對靶點與疾病靶點的映射，預測潛在機制通路富集，并在進一步的動物試驗中，驗證了QFZTS藥理作用的預測通路。

本研究PPI網絡分析顯示，IL-1β、IL-6、TNF、CCL2、MMP9、NLRP3、CASP1、PTGS2、TGF-β1是頂部節(jié)點重要靶點，KGEE結果顯示，IL-17、AGERAGE、TNF、NOD樣受體和NF-κB等信號通路與QFZTS治療AGA潛在作用機制密切相關。以上結果從理論機制層面上證明QFZTS通過多組分、多靶點、多途徑的方式發(fā)揮治療AGA的作用。

AGA是由關節(jié)腔內尿酸濃度過高形成MSU晶體而引起的。MSU晶體被組織中巨噬細胞識別，觸發(fā)機體固有免疫反應，誘發(fā)炎癥聯級反應，導致嚴重關節(jié)炎癥，過度和不間斷的炎癥會損害健康組織，最終導致軟骨變性和關節(jié)損傷[14]。在這個過程中，大量炎癥因子和細胞內容物的釋放被認為是AGA發(fā)病的關鍵[15]。同時，結合網絡藥理學結果可知，QFZTS治療AGA機制可能與IL-17、TNF和NOD等炎癥信號通路密切相關。此外，已有研究證實，MSU可通過一系列反應促進NLRP3炎性小體形成，NLRP3通過激活Caspase-1和IL-1β，激活NOD受體家族信號通路進而誘導痛風炎癥[16]。綜合考慮現有研究所揭示NLRP3在痛風性關節(jié)炎等炎癥疾病發(fā)病中的重要性，本課題組認為NOD樣受體信號通路中NLRP3、Caspase-1、IL-1β靶點可能是QFZTS在AGA治療中的關鍵。

NOD樣受體蛋白—NLRP3炎性小體可被多種病原體和危險因子激活，其中MSU是常見的危險因子之一[17]。激活的NLRP3通過ASC激活pro-Caspase-1，活化Caspase-1將pro-IL-1β 切割成IL-1β，而IL-1β是痛風性關節(jié)炎中調節(jié)細胞分化、增殖和凋亡的關鍵炎癥介質，可誘導多種細胞因子和趨化因子的表達，如TNF-α、IL-6和IL-8的釋放[18]。本研究顯示，經QFZTS治療后，MSU誘導的AGA大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著下降；滑膜組織損傷較模型組減輕，滑膜增生受到抑制，炎癥反應明顯減弱；NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達受到抑制。初步證實，QFZTS能有效緩解MSU引起的AGA，其可能通過干預NOD樣受體信號通路，下調NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平，抑制炎癥反應，與網絡藥理學預測結果相一致。

TGF-β1是由成熟巨噬細胞分泌產生的一種多功能細胞因子，主要通過阻礙內皮細胞活化，降低白細胞黏附聚集，激活炎癥信號通路，進而促進炎癥因子釋放[19]。MSU晶體在關節(jié)腔內沉積后，刺激TGF-β1過度分泌，從而激活TAK1，促進MKK激酶激活P38MAPK磷酸化，活化的P38MAPK可誘導下游NF-κB信號通路的高表達，最終促進IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1等炎癥因子的活化，加重關節(jié)炎癥損傷[20]。結合網絡藥理學和體內實驗結果可知，NFκB信號通路為QFZTS和AGA共同信號通路，且關聯度高，QFZTS干預后的AGA大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平下降，提示TGF-β1/P38MAPK/NF-κB通路可能是QFZTS治療AGA的另一途徑，仍需通過實驗進一步驗證。

本研究采用網絡藥理學聯合動物體內實驗分析了QFSTS治療AGA的作用機制，初步證實QFZTS可通過調節(jié)NOD樣受體信號通路，抑制NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達，降低IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1的釋放，從而減輕炎癥反應。