褐藻多糖的體外抗氧化活性及其延長秀麗隱桿線蟲的壽命

王猛，關(guān)思宇，于杰，薛金愛，狄建兵，王愈，姜進舉，崔紅利*，李潤植*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷 030801）（2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801）（3.海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室，山東青島 266400）

氧化應(yīng)激是機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧（Reactive oxygen species，ROS）過度積累，細(xì)胞氧化程度超出了氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，進而導(dǎo)致細(xì)胞衰老，造成組織損傷[1]。Harman等[2]研究表明，體內(nèi)氧自由基反應(yīng)失衡使得細(xì)胞富集大量ROS，進而加速細(xì)胞衰老。衰老是生命周期中必然經(jīng)歷的生理過程，衰老導(dǎo)致生物體自我更新能力和修復(fù)能力被削弱，此外，衰老常伴隨多種慢性疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、糖尿病和心血管疾病等[3]。因此，當(dāng)體內(nèi)抗氧化酶難以抵擋自由基的過度富集，需要補充天然無毒的抗氧化劑來緩解細(xì)胞損傷。天然活性多糖因毒副作用小而備受關(guān)注。Feng等[4]研究證明，三七多糖雖對ROS的清除能力較弱，但是能顯著延長線蟲壽命，且該多糖對熱應(yīng)激的作用可能與提高抗氧化酶活性和降低脂質(zhì)過氧化有關(guān)；潘子康[5]研究證明，小球藻多糖在抗氧化脅迫實驗中提高了線蟲的存活時間，提高了線蟲耐熱能力并且提高了線蟲L4期的運動能力。

褐藻多糖（Fucoidan-containing sulfated polysaccharide，F(xiàn)SP）是褐藻細(xì)胞壁基質(zhì)中的一種天然硫酸化多糖[6]。研究表明，F(xiàn)SP具有抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等多種生理活性[7,8]。先前研究表明，F(xiàn)SP是一種能夠清除自由基和調(diào)節(jié)代謝的天然產(chǎn)物，這可能是由于多糖復(fù)雜的結(jié)構(gòu)中帶著不同數(shù)量的活性羥基和活性氫的緣故，這些活性基團特異性識別并配對單自由基，通過改變其結(jié)構(gòu)達(dá)到清除自由基的作用[9]。Wang等[10]發(fā)現(xiàn)，不同藻類提取的FSP抗氧化能力也大不相同，且硫酸根含量與超氧陰離子自由基清除能力呈正相關(guān)；栗曉慶等[11]認(rèn)為，通過堿提法獲得的FSP自由基清除率高，還原力較弱，在體外表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。此外，F(xiàn)SP抗氧化能力的關(guān)鍵是其分子量及硫酸根含量[12]。先前的研究多集中于體外驗證，然而其體內(nèi)驗證及分子機制尚不明確。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是一種存在于土壤中的食菌生物，因其生命周期短、易維護、可獲得數(shù)千個突變株，被廣泛用作研究抗氧化、抗衰老、抗阿爾茲海默癥、抗糖尿病藥物作用的模式生物[13]。胰島素/類胰島素樣生長因子（Insulin/IGF-1，IIS）是調(diào)節(jié)生命周期且高度保守的信號通路，在線蟲的發(fā)育、代謝和衰老過程中起關(guān)鍵作用[14]。研究表明，天然多糖通過調(diào)節(jié)某些信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)控線蟲的衰老[15]。Yuan等[16]證明地黃中性多糖通過IIS增強線蟲的抗應(yīng)激能力，從而延長線蟲壽命；Zhang等[17]報道枸杞多糖主要通過sir-2.1、daf-12和daf-16延長了線蟲的壽命?；诖耍茰yFSP通過調(diào)控Insulin/IGF-1信號通路增強線蟲抵抗氧化應(yīng)激的能力。目前，對FSP體外抗氧化研究較多，但是其抗氧化及抗衰老的機理研究鮮有報道。本研究以秀麗隱桿線蟲為模式動物，研究FSP抗氧化性及其作用機理，為其作為天然食品開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用褐藻多糖（即巖藻多糖）FSP來自于裙帶菜，由青島明月海藻集團有限公司姜進舉博士惠贈。FSP的化學(xué)組成如表1所示，其中，F(xiàn)SP的總糖和總蛋白的含量分別為70.4%和4.77%，糖醛酸含量為7.22%，硫酸基含量為21.5%，巖藻糖含量為63.38%。菌株購自美國線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）：N2株系；Nematode Growth Medium（NGM）培養(yǎng)基，尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（Escherichia coli）OP50，DPPH、抗壞血酸，磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH=7.8），Trizol試劑（上海生工），PrimeScript RT試劑盒（Takara），BCA蛋白試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒采購自南京建成生物技術(shù)公司。

表1 褐藻多糖化學(xué)組成Table 1 The chemical composition of FSP

1.2 方法

1.2.1 羥基自由基清除率的測定

在試管中加入0.5 mL不同濃度的FSP溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）、0.5 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、0.5 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，混勻后加入0.5 mL 9 mmol/L的H2O2溶液，在37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h后于510 nm處測定其吸光度值，Vc作為陽性對照。

式中：

A0——水代替樣品測得的吸光度值；A1——多糖溶液測得的吸光度值；A2——乙醇代替水楊酸-乙醇溶液測得的吸光度值。

1.2.2 超氧陰離子清除率的測定

樣液配制同1.2.1，向具塞玻璃試管中分別加入0.026 mol/L的甲硫氨酸1.5 mL，500 μL的磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH=7.8），然后加入300 μL的核黃素（0.02 mmol/L）和300 μL NBT（0.75 mmol/L），混勻后在光照下反應(yīng)30 min，同時以蒸餾水作為空白對照A0，以不同濃度的Vc作為陽性對照，測定560 nm處的吸光值A(chǔ)，按照如下公式計算清除率。

1.2.3 總還原力測定

將1 mL不同濃度FSP（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）放入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）中，與2.5 mL鐵氰化鉀（1%，m/V）混合，50 ℃反應(yīng)20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（10%，m/V）終止反應(yīng)，5000 r/min離心10 min后取2.5 mL上清液與2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3（0.1%，m/V）混合，靜置10 min后于700 nm處測定各組吸光度值，Vc作為陽性對照。

1.2.4 FSP對線蟲壽命及運動能力的影響

隨機挑取20條同期化至L4期線蟲分為4組，分別將其接種至不含或含有不同濃度FSP-L（50 μg/mL）、FSP-M（100 μg/mL）、FSP-H（200 μg/mL）的NGM培養(yǎng)基飼養(yǎng)（飼喂OP50，同時為防止排卵影響每天轉(zhuǎn)板）。每組3次重復(fù)，每板20條，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時記為線蟲壽命的第0 d。每天更換新鮮培養(yǎng)基，第2 d起，在顯微鏡下觀察線蟲存活狀態(tài)，死亡標(biāo)準(zhǔn)以用picker輕碰線蟲，線蟲頭部或身體不擺動彎曲為準(zhǔn)，每天對各板中線蟲死亡數(shù)詳細(xì)記錄，計算存活率；鉆入培養(yǎng)基的線蟲及由于其他因素死亡的線蟲將從統(tǒng)計數(shù)據(jù)中排除，以生存率百分比為縱坐標(biāo)繪制生存曲線。

線蟲運動能力檢測根據(jù)參考文獻[18]。實驗組各挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)木€蟲放置在2%的瓊脂糖凝膠上，先讓線蟲運動約兩分鐘適應(yīng)環(huán)境，在體式顯微鏡下觀察30 s內(nèi)線蟲頭部的擺動次數(shù)并記錄，用以評價線蟲運動能力的指標(biāo)。一次頭部擺動是指線蟲的頭部呈弓形運動（每組檢測線蟲數(shù)目最少15條）。

1.2.5 脂褐素及細(xì)胞凋亡熒光檢測

制作2%瓊脂糖凝膠，倒在培養(yǎng)皿蓋里，厚度大概控制在1～3 mm，凝固后，切下一小塊瓊脂放在載玻片上，將線蟲挑在培養(yǎng)基上，于熒光顯微鏡激發(fā)485 nm、發(fā)射530 nm波長藍(lán)光觀察。

線蟲細(xì)胞凋亡程度采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚熒光染色法[19]（DAPI）測定：取線蟲培養(yǎng)平板，切除2.0 cm×2.0 cm的瓊脂，加入M9緩沖液低速離心后收集蟲體。熒光檢測前，將0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液與甘油等體積混合，pH=9.5，每個蟲體樣品避光染色10 min，用磷酸鹽-生理鹽水緩沖液沖洗3次，熒光顯微鏡激發(fā)360 nm、發(fā)射400 nm波長紫外光下鏡檢。

1.2.6 H2O2誘導(dǎo)的急性氧化應(yīng)激

隨機挑取30條同期化至L4期線蟲分為4組，分別將其接種至不含或含有不同濃度FSP-L（50 μg/mL）、FSP-M（100 μg/mL）、FSP-H（200 μg/mL）的NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，將培養(yǎng)2 d后的線蟲急性暴露于0.1% H2O2的48孔板內(nèi)，每孔10條，每組三次重復(fù)，每隔30 min計數(shù)線蟲的存活個數(shù)，繪制生存曲線，直至全部死亡。

1.2.7 抗氧化酶測定

按1.2.4壽命實驗線蟲培養(yǎng)方法，用3 mL磷酸鹽緩沖液收集線蟲至10 mL離心管，設(shè)置破碎功率和時間分別為800 W和8 min對線蟲組織破碎，之后對破碎的組織液離心，離心后取上清[20]。按照BCA試劑盒測定蛋白濃度，SOD試劑盒和CAT試劑盒測定線蟲酶活。

1.2.8 mRNA提取及熒光定量PCR檢測

將同期化L4期線蟲FSP處理后，培養(yǎng)2 d。收集蟲體于離心管中，PBS緩沖液清洗3次。Trizol法提取線蟲的總RNA，Primer 5.0設(shè)計相關(guān)基因引物。用SYBR Green為DNA熒光染料，實時熒光定量PCR測定，以β-actin為內(nèi)參測定daf-16及其下游靶基因的表達(dá)量，基因表達(dá)以PCR的2-ΔΔCt值表示。

表2 秀麗隱桿線蟲抗氧化基因?qū)崟r定量PCR引物Table 2 Real time quantitative PCR primers for antioxidant genes of C. elegans

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本文數(shù)據(jù)處理采用Graghpad Prism 5.0，p＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用One-way ANOVA進行處理，活力脂褐素以及DAPI熒光顯微鏡拍照，作圖用Origin 9.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSP對羥基自由基的清除作用

羥基自由基（·OH）是重要的活性氧之一，氧化能力強且危害性較大。因此，研究FSP對羥基自由基的清除作用是FSP抗氧化性研究中重要的部分。Fenton 反 應(yīng)（Fe2++H2O2=·OH+OH-+Fe3+）產(chǎn)生·OH，·OH與水楊酸反應(yīng)生成2,3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)在510 nm處有一個特殊的吸收峰。研究表明，在體系中若加入抗氧化劑時，會產(chǎn)生的較少的·OH，吸光度降低[21]。本試驗中通過Fenton法測定褐藻多糖對·OH清除效果，如圖1所示。在0.1～0.5 mg/mL濃度時FSP對·OH清除作用呈顯著的濃度依賴性，當(dāng)FSP的濃度為0.5 mg/mL時，對羥基自由基的清除率是30.13%。FSP對羥基自由的清除活性低于張志東等[22]提取的從大連海域得到的褐藻多糖，當(dāng)褐藻多糖濃度為0.6 mg/mL時，清除率達(dá)50%。

2.2 FSP對超氧陰離子自由基的清除作用

作為機體誘發(fā)脂質(zhì)過氧化的原因之一，超氧陰離子自由基是氧化反應(yīng)過程中最先產(chǎn)生的一種自由基。如圖2所示，F(xiàn)SP具有清除超氧陰離子的能力，但相比于Vc，其清除率較低。在濃度為0.1～0.5 mg/mL內(nèi)，F(xiàn)SP對超氧陰離子自由基的清除率呈劑量依賴性增加，并在0.5 mg/mL時，趨于平緩，清除率達(dá)41.13%。本實驗研究結(jié)果，與王雪等[23]結(jié)果相似，羊棲菜褐藻糖膠超氧陰離子清除能力隨多糖的濃度的增加而增強，但是此清除率低于其實驗結(jié)果。

2.3 FSP的總還原力

所測樣品將K3Fe(CN)6還原成K4Fe(CN)6，與Fe3+反應(yīng)產(chǎn)生普魯士藍(lán)，在700 nm波長處檢測普魯士藍(lán)的吸光度，吸光度值越高，樣品的還原能力越強。如圖3所示，在不同濃度下，所測樣品的還原能力都很低。隨著FSP濃度的增加，F(xiàn)SP的還原能力并未有顯著變化，當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時，在700 nm處，F(xiàn)SP最大吸光度也沒有超過0.07，這一結(jié)果可能與實驗所用多糖的含糖量有關(guān)。先前研究結(jié)果表明，隨著吸光度不斷增加，還原力逐漸增強，12 mg/mL的羊棲菜褐藻多糖的吸光度值為1.49。盡管本試驗中多糖還原力較低，但我們也能發(fā)現(xiàn)吸光度值與多糖濃度呈正相關(guān)趨勢[24]。

2.4 FSP對線蟲壽命及運動能力的影響

在衰老過程中，機體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)逐漸衰退，最終導(dǎo)致生命的終結(jié)。壽命長短作為抗衰老研究的定量指標(biāo)，具有重要意義。如圖4a所示，隨著FSP濃度的增加，線蟲存活曲線向右移，表明其最大壽命延長；圖4b所示，與對照組相比，F(xiàn)SP干預(yù)后線蟲的平均壽命顯著（p＜0.05）提高，其中FSP-L、FSP-M和FSP-H組線蟲的平均壽命較對照組分別延長了7.24%、26.70%和48.42%。綜上，在一定濃度梯度內(nèi)FSP顯著（p＜0.05）延長了線蟲的壽命。Zhang等[25]的研究結(jié)果表明，高劑量的毛竹多糖處理的線蟲，平均壽命為27.3 d；張宗敏等[26]研究表明，與空白對照組相比，金釵石斛多糖顯著延長秀麗隱桿線蟲的平均壽命，質(zhì)量濃度為0.24 mg/mL的多糖延長了33.89%。本研究發(fā)現(xiàn)FSP可以延長線蟲壽命，且作用效果呈劑量依賴性，證明了攝食活性物質(zhì)可以延長線蟲壽命。

隨著機體的衰老，運動能力也會減弱，頭部擺動和身體彎曲頻率常作為分析線蟲運動能力的指標(biāo)。為了探究FSP是否可以減緩因衰老所致的線蟲運動能力下降，本實驗選擇線蟲的頭部擺動次數(shù)為評價指標(biāo)。從表3中可看出，與CK相比，F(xiàn)SP干預(yù)后線蟲的頭部擺動次數(shù)顯著增加，并呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)給予FSP多糖濃度為50、100、200 μg/mL時，其運動能力比對照組分別增加了14.62%、35.52%和73.50%，每組之間均有顯著（p＜0.05）差異。Gu等[27]研究黑木耳多糖對線蟲生物學(xué)功能的影響中指出，0.8 mg/mL的黑木耳多糖能顯著增加線蟲的頭部擺動頻率，且線蟲頭部擺動與多糖濃度呈劑量依賴性，與本研究結(jié)果相一致。

表3 FSP對線蟲運動能力的影響Table 3 Effect of FSP on the head swing of C. elegans

2.5 FSP對線蟲體內(nèi)脂褐素和細(xì)胞凋亡的影響

脂褐素[28]是線蟲氧化應(yīng)激和衰老的指示劑，是一種自發(fā)熒光色素，脂褐素含量隨線蟲年齡的增加而逐漸增加，過多的脂褐素沉淀會對線蟲的機體造成損害，最終加速線蟲的衰老。由圖5可知，在線蟲的同一時期，F(xiàn)SP處理組的線蟲體內(nèi)自發(fā)的熒光強度較對照組均有不同程度的降低，所以FSP可以減緩線蟲體內(nèi)脂褐素的積累，從而延緩線蟲的衰老進程。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測[19]，細(xì)胞形態(tài)的變化如包膜褶皺或出泡，核染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化等都可作為細(xì)胞凋亡的證據(jù)。DAPI染色結(jié)果表明，對照組中細(xì)胞核染色質(zhì)高度聚集，形態(tài)改變，而FSP一定程度上緩解了細(xì)胞凋亡程度且呈劑量依賴性。有研究報道，青錢柳多糖在線蟲生命周期的不同階段均能顯著降低年齡色素的積累[29]。張曉寒等[30]的研究表明，隨著線蟲生命的進程，機體衰老導(dǎo)致體內(nèi)脂褐素堆積，根皮素能顯著降低體內(nèi)脂褐素含量，作用效果呈劑量依賴性，其中75 μg/mL的根皮素脂褐素水平較正常組降低了36.96%。Suetomi等[31]研究表明，在線蟲衰老過程中，伴隨著細(xì)胞失活，凋亡的細(xì)胞在DAPI染色后，呈現(xiàn)亮藍(lán)色，天然的活性物質(zhì)一定程度上會延緩衰老、緩解細(xì)胞凋亡程度，本研究結(jié)果表明，200 μg/mL的褐藻多糖能夠緩解細(xì)胞凋亡程度。

2.6 FSP對線蟲應(yīng)激能力的影響

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是誘發(fā)衰老的風(fēng)險因素，線蟲抵抗氧化應(yīng)激能力與壽命密切相關(guān)，氧化應(yīng)激會加速線蟲的衰老甚至死亡，這可能是由于氧化劑引起的DNA損傷[32]。線蟲壽命的延長與抗壓能力的增強有關(guān)。為了全面評價FSP的抗逆性，測定了線蟲對氧化應(yīng)激的抗性。H2O2可產(chǎn)生羥基自由基，會促進細(xì)胞氧化損傷，所以選擇0.1%的H2O2致線蟲急性氧化應(yīng)激。由圖6可知，對照組在氧化應(yīng)激3.5 h時，線蟲已無存活，但是在4.5 h時，F(xiàn)SP-M、FSP-H組存活率還為3.3%和6.7%，經(jīng)FSP處理后，生存曲線顯著右移，線蟲的平均壽命均顯著（p＜0.05）增加，且與空白對照組相比分別增加了4.3%、37.2%、62%（表4）。先前研究表明，根皮素可有效保護線蟲抵抗氧化應(yīng)激的影響[30]，且75 μg/mL的根皮素處理后線蟲平均壽命延長了35.96%。

表4 FSP對線蟲氧化應(yīng)激下壽命的影響Table 4 Effect of FSP on longevity of C. elegans under oxidative stress

2.7 FSP對線蟲抗氧化酶活力的影響

抗氧化酶活性及含量直接影響了機體在氧化損傷中的免疫能力[33]。由圖7可知，線蟲體內(nèi)SOD活性和CAT活性均與FSP濃度呈一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。FSP顯著（p＜0.05）增強了SOD和CAT活性。其中FSP-L、FSP-M、FSP-H分別提高SOD活力48.48%、75.91%和82.75%，CAT活性分別增強了58.26%、65.85%和74.95%。結(jié)果表明，F(xiàn)SP通過促進線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性清除自由基。先前研究表明，南瓜多糖及其降解產(chǎn)物能顯著提高SOD和CAT等抗應(yīng)激相關(guān)的抗氧化酶活性[34]。Wang等[35]的結(jié)果表明，400 mg/mL的橘皮素能夠顯著（p＜0.05）提高抗氧化酶活性，與對照組相比，分別提高了2.9倍和2.2倍。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL的FSP顯著提高了CAT及SOD活性，與對照組相比分別提高了1.75倍和1.83倍。

2.8 FSP對線蟲基因表達(dá)的影響

為了進一步檢測FSP對線蟲體內(nèi)抗氧化分子機制，利用PCR技術(shù)對（圖8）Insulin/IGF-1信號通路上關(guān)鍵因子進行分析。Insulin/IGF-1信號通路在調(diào)控線蟲衰老中扮演著重要的角色[36]，該通路主要起調(diào)節(jié)作用的信號基因有daf-2、daf-16和skn-1[37]。在IIS中，轉(zhuǎn)錄因子daf-16是調(diào)控長壽的關(guān)鍵因子；而其上游基因daf-2可以負(fù)向調(diào)控該通路[38]，當(dāng)daf-2的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制時，daf-2下游的daf-16在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)增加，從而達(dá)到抗壓、延長壽命的效果[39]。此外，線蟲轉(zhuǎn)錄因子skn-1也可以通過激活第二階段的解毒反應(yīng)來抵抗氧化應(yīng)激，而且skn-1延長壽命的機制是獨立于daf-16的[40]。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)FSP處理后，線蟲體內(nèi)daf-2的基因表達(dá)較對照組顯著（p＜0.05）下調(diào)，而daf-16和skn-1的基因表達(dá)顯著（p＜0.05）升高，提示FSP通過下調(diào)daf-2基因和上調(diào)daf-16基因延長線蟲的壽命。本研究結(jié)果與大多植物多糖抗衰老作用的機制相似[41]，F(xiàn)SP通過調(diào)節(jié)Insulin/IGF-1信號通路關(guān)鍵基因的表達(dá)進而調(diào)控線蟲衰老。

3 結(jié)論

FSP已被證明具有多種生理活性且具有潛在的藥用價值。以其抗氧化作用為例，本實驗首先研究FSP體外抗氧化活性，隨后研究其在體內(nèi)抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SP可有效延緩線蟲壽命，提升線蟲抗氧化酶活性，通過影響Insulin/IGF信號通路上關(guān)鍵基因表達(dá)進而參與了線蟲衰老過程的調(diào)控。綜上，本研究為FSP抗氧化研究提供實驗依據(jù)，同時為天然抗氧化劑及抗衰老輔助因子的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，但線蟲氧化應(yīng)激分子機制較為復(fù)雜，更深入的分子水平研究有待進一步開展。