柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵工藝的優(yōu)化

徐家豪，林靜嫦，張舒寧，董思遠，鐘先峰，陳文勝，陳禮培

（佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術研究中心，廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心，佛山市釀造工程技術研究中心，佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術研究中心，廣東佛山 528231）

新會柑橘，又稱茶枝柑，產(chǎn)自廣東新會，是中國地理標志性產(chǎn)品，新會柑橘有豐富的蘋果酸、維生素C、 糖類、類黃酮、柚皮苷等營養(yǎng)物質[1]，具有抗氧化、抗突變、抗癌等多種生物活性，對心腦血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生具有一定預防作用[2]。新會柑橘果皮常被制作成陳皮，而其果肉則因味酸而較少被利用，當作廢料處理，這種“留皮棄肉”的處理方式，造成了資源浪費，同時也造成了一定的環(huán)境污染[3]。

紅茶是產(chǎn)量最多且消費最廣的茶，占據(jù)了全球茶銷量的80%[4]。由于其獨特的香氣、味道、顏色及有益健康的特性，紅茶已成為最令人愉悅和受歡迎的飲品之一[5]。英德紅茶是廣東著名紅茶，中國地理標志性產(chǎn)品，以其湯色紅亮、香氣濃郁而聞名[6]，受到國內外消費者的廣泛青睞，其含有多酚類物質、茶黃素等活性成分[7]，具有抗氧化[8]，抑菌[9]，解毒抗癌[10]等功效。近年來，以紅茶為原料研發(fā)的紅茶菌飲料不斷進入消費市場[11]。紅茶菌飲料是一種起源于中國的傳統(tǒng)發(fā)酵飲料[12,13]，以紅茶糖水為原料，由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌[14]組成共生菌群混合發(fā)酵而成[15]，不但保留了紅茶本身的飲用價值，同時兼具獨特的發(fā)酵風味和保健作用[16]。本研究以廣東特產(chǎn)-新會柑橘和英德紅茶為原料，利用紅茶菌，通過添加柑橘汁混合發(fā)酵生產(chǎn)柑橘紅茶菌飲料，并對柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵工藝進行探究。首先通過單因素試驗，探究乳酸菌添加量、糖添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對紅茶菌飲料的影響，再通過響應面法優(yōu)化柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵工藝，最終得到制備柑橘紅茶菌飲料最優(yōu)發(fā)酵工藝，以期為實現(xiàn)廣東特色產(chǎn)品融合開發(fā)，提高新會柑橘和英德紅茶附加值，拓寬其應用領域提供理論依據(jù)，也為柑橘紅茶菌飲料研發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新會柑橘；紅茶葉，購自茶里集團有限公司；蔗糖，福正東海食品有限公司；乳酸菌，本實驗室篩選鑒定保藏的食品源乳酸菌菌株，制成菌粉備用；葡萄酒果酒酵母菌，購自安琪酵母有限公司；醋酸菌，適用于醋酸發(fā)酵，購自濟寧玉園生物科技有限公司；福林酚、沒食子酸、檸檬酸、碳酸鈉、無水乙醇、無水碳酸鈉，購自廣州化學試劑公司；果膠酶（食品級），購自康達生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7200型可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；JYL-C93T型榨汁機，九陽股份有限公司；WAY-2WAJ型阿貝折光儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司；GR60DA型全自動滅菌鍋，致微儀器有限公司；FE28-Standard型pH計、ME104型電子天平（萬分之一），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柑橘紅茶菌飲料流程

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 柑橘汁制備流程

根據(jù)婁明等[17]的制備方法制備柑橘汁。

1.3.2.2 糖茶水制備流程

根據(jù)茶里紅茶品牌推薦的浸泡方法，取2包紅茶包于500 mL沸水中浸泡3 min，浸泡完畢后，取出茶包，加入蔗糖（80 g/L)，再次煮沸10 min，進行滅菌處理[18]。

1.3.2.3 混合、調配

將柑橘汁和糖茶水按照1:1的比例混合，根據(jù)實驗探究加入蔗糖調配初始糖量，得到柑橘果汁紅茶液。

1.3.2.4 接種、發(fā)酵

在柑橘果汁紅茶液中加入一定量的酵母菌粉、乳酸菌粉、醋酸菌粉，攪勻，置于32 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵，糖度和pH趨于穩(wěn)定時發(fā)酵停止。

1.3.2.5 過濾、滅菌、裝罐

發(fā)酵完后，取發(fā)酵液上清液，用8層紗布過濾，得澄清液體，調配糖度和酸度后，進行高溫滅菌（100 ℃，10 min），冷卻后，裝罐，于4 ℃冷藏保存。

1.4 指標測定

1.4.1 pH測定

便攜式/臺式酸度計測量pH，參照GB/T 11165-2005的測定方法。

1.4.2 可溶性固形物測定

可溶性固形物測定，參照GB/T 12143-2008飲料通用分析方法。

1.4.3 柑橘紅茶菌飲料感官評價

通過感官評價探究飲料的工藝條件。感官評價由10名經(jīng)過感官評價訓練、有經(jīng)驗的評定員，進行評定。根據(jù)分級測試評價的要求，從色澤、口感、風味、組織狀態(tài)等4個方面對柑橘紅茶菌飲料的品質進行評分，滿分100分。柑橘紅茶菌飲料的評定標準見表1。

表1 柑橘紅茶菌飲料感官評價評分表Table 1 Sensory evaluation scale of citrus kombucha beverage

1.5 發(fā)酵工藝的確定

1.5.1 單因素試驗

經(jīng)文獻調研可知，影響柑橘紅茶菌發(fā)酵的主要因素有：發(fā)酵菌（酵母菌、醋酸菌、乳酸菌）比例[19]、蔗糖添加量[20,21]、發(fā)酵時間[22]和發(fā)酵溫度[23]。這些因素能夠影響微生物的生長及最終代謝產(chǎn)物，從而影響最終產(chǎn)品品質。pH反映了有機酸產(chǎn)生情況，同時影響著飲料風味[24]，感官評定能反映飲料的品質及風味；消耗的可溶性固形物水平反映了微生物的生長過程[19]，故本研究以pH、感官評定、可溶性固形物消耗量為響應值，通過單因素試驗，確定單因素水平范圍，然后利用Box-Behnken響應面優(yōu)化方法探究各因素對柑橘紅茶菌飲料的綜合影響，以確定柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵工藝。

1.5.1.1 乳酸菌粉添加量

紅茶菌主要由酵母菌、醋酸菌、乳酸菌組成。而乳酸菌可發(fā)酵糖類物質產(chǎn)生乳酸等多種有機酸，且具有促進營養(yǎng)物質吸收、增加人體有益菌群、抗氧化等多種益生功能。研究表明[22]，紅茶菌中的乳酸菌不僅可以改善紅茶菌飲料風味，且可以提高醋酸菌的存活率和產(chǎn)有機酸能力。鑒此，發(fā)酵菌比例選擇，以乳酸菌添加量變化為主導，在自然pH值下，固定酵母菌、醋酸菌添加量分別為0.10%，固定初始糖量為15%，于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d。在乳酸菌粉添加量為0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%的情況下，探究乳酸菌粉添加量對柑橘紅茶菌飲料品質的影響。

1.5.1.2 蔗糖添加量

在自然pH值下，乳酸菌粉添加量為0.40%，于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d。分別加入蔗糖1.80、5.50、8.80、12.50、16.70 g于100 mL的柑橘果汁紅茶菌發(fā)酵液中，調配成糖量分別為5%、10%、15%、20%、25%的樣品，探究蔗糖添加量對柑橘紅茶菌飲料品質的影響。

1.5.1.3 發(fā)酵溫度

在自然pH值下，乳酸菌粉添加量為0.40%，初始糖量固定為15%，于恒溫生化培養(yǎng)箱發(fā)酵5 d。柑橘果汁紅茶菌發(fā)酵液分別放置于溫度為24、28、32、36、40 ℃。探究發(fā)酵溫度對柑橘紅茶菌飲料品質的影響。

1.5.1.4 發(fā)酵時間

在自然pH值下，乳酸菌粉添加量為0.40%，初始糖量固定為15%。柑橘果汁紅茶菌發(fā)酵液分別發(fā)酵1、2、3、4、5、6 d，探究發(fā)酵時間對柑橘紅茶菌飲料品質的影響。

1.5.2 響應面試驗設計

研究表明，在紅茶菌飲料發(fā)酵過程中，pH反映了有機酸產(chǎn)生情況，同時也反映了紅茶菌菌群活性，且對飲料風味影響較大[25]，鑒此，本研究在單因素試驗結果基礎上，使用Box-Benhnken試驗設計，以柑橘紅茶菌飲料pH值為響應值，探究乳酸菌粉添加量（A）、蔗糖添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D），4個因素對柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵的影響，采用Box-Behnken模型進行四因素三水平試驗設計，試驗因素與水平如表2所示。

表2 響應面試驗水平及因素Table 2 Response surface test level and factors

1.5.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2019和Design-Expert 8.0.6軟件作數(shù)據(jù)分析，采用OriginPro 2018作圖，每個試驗重復3次及以上，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 乳酸菌粉添加量對柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵的影響

紅茶菌飲料的特點之一是有機酸含量豐富，而有機酸含量與pH值呈一定正相關性[26]。Coelho等[14]研究認為，紅茶菌飲料的pH最佳范圍是2.5～4.2。在此范圍內，pH越低，有機酸越豐富，并對人體不會造成危害。紅茶菌主要由醋酸菌、酵母、乳酸菌組成[27]。乳酸菌作為益生菌，具有抗氧化、改善腸道菌群等益生特性，它可利用糖類產(chǎn)生乳酸[28]，且能提高醋酸菌存活率和產(chǎn)有機酸能力[29]。在傳統(tǒng)紅茶菌飲料（醋酸菌和酵母發(fā)酵）的基礎上添加乳酸菌，能影響菌群對碳水化合物的利用和菌體的生長，同時使得發(fā)酵過程中的代謝途徑發(fā)生變化，導致代謝產(chǎn)物及其產(chǎn)量也有所不同。添加了乳酸菌的紅茶菌飲料，能產(chǎn)生更多的健康有機酸，改善飲料風味，氣味更加柔和，降低刺激酸味[30]，同時提高飲料益生功效。本研究結果如圖2所示。隨著乳酸菌粉添加量的增加，感官評價得分的趨勢是先增加后下降，乳酸菌粉添加量為0.40%時，感官評價得分最高，為88.47分，此時的柑橘紅茶菌飲料香氣協(xié)調，茶味、果香味及酸味巧妙結合，滋味酸甜可口，色澤為橘黃色，澄清透明；乳酸菌粉添加量為0.40%時，紅茶菌飲料pH最低，為3.44。乳酸菌添加量為0.40%和0.60%時，可溶性固形物的消耗值沒有顯著性差異（p＞0.05）。結合成本問題考慮，選擇最佳乳酸菌添加量為0.40%。

2.1.2 蔗糖添加量對柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵的影響

蔗糖不僅可以作為紅茶菌飲料發(fā)酵的碳源，還可以作為甜味劑來調節(jié)飲料口感的酸甜比。由圖3可以看出，在一定范圍內，感官評分會隨著蔗糖添加量的增加而升高。但蔗糖添加量過大時，糖未完全消耗完，液體渾濁，香氣帶有略微的酒香和甜膩，滋味較澀，導致感官評分下降；而蔗糖添加量過少時使得飲料香氣和滋味帶有著茶澀味；蔗糖添加量在15%時，柑橘紅茶菌飲料清澈透明，呈現(xiàn)橘黃色，香氣酸甜，無酒味和澀味，此時感官評分最高，為86.7分；而隨著蔗糖添加量的增加，pH值呈先下降后上升的趨勢，可溶性固形物消耗量呈先上升后下降的趨勢，當蔗糖添加量為15%時，pH值最低，為3.71；可溶性固形物消耗量最高，為11.77%，說明此時紅茶菌代謝活力較強。因此，本研究蔗糖的最佳添加量選為15%。在發(fā)酵過程中，蔗糖是主要的碳源和能源，紅茶菌利用蔗糖代謝原理是酵母通過轉化酶將蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并通過糖酵解產(chǎn)生乙醇[31]，代謝產(chǎn)物作為醋酸菌和乳酸菌代謝產(chǎn)生有機酸的底物被利用，同時酵母也會合成易揮發(fā)的酸性酯類，和對發(fā)展康普茶香氣非常重要的果味芳香化合物[32]，為柑橘紅茶菌飲料提供風味，提升品質。因為醋酸菌不能直接利用蔗糖，而醋酸菌將酵母代謝產(chǎn)生的葡萄糖和乙醇轉化為乙酸及其他有機酸[28]。

2.1.3 發(fā)酵時間對柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵的影響

柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵是三種菌混合發(fā)酵的相對復雜的體系，無法完全根據(jù)某一種菌的生長特性而設定對應的發(fā)酵時間。添加了乳酸菌的紅茶菌飲料，發(fā)酵所需的時間會比傳統(tǒng)紅茶菌飲料的發(fā)酵所需的時間要短，促進了酵母和醋酸菌的代謝作用，也加快了對碳水化合物的利用[22]。通過初步測定發(fā)酵1 d到6 d的飲料指標變化，以找到合適的發(fā)酵時間。結果如圖4所示，發(fā)酵時間在1 d時，液體較為渾濁，且顏色偏暗橘黃色，氣味較不協(xié)調，有很淡的酒香味。而發(fā)酵在第5 d以上，液體較為澄清呈橘黃色，具有濃郁的茶澀味，酸甜味適宜但帶有雜味。而發(fā)酵第4 d時，感官評價分值達到最大，為87.63分，此時柑橘紅茶菌飲料呈澄清亮橘黃色溶液，酸甜味適宜，滋味和氣味協(xié)調，同時飲料的pH最低，可溶性固形物消耗量最大。在發(fā)酵前期，有較充足的物質供微生物生長繁殖，其可充分利用蔗糖轉化成有機酸[33]，致使發(fā)酵液pH下降。發(fā)酵4 d后pH值稍有上升，推測有機酸進行了轉化或者與某些物質發(fā)生了反應[34]，致使有機酸含量略有降低，pH值稍有上升。由以上結果可知，柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵4 d時，pH為3.65，可溶性固形物的消耗值達12.23%，其品質較好。

2.1.4 發(fā)酵溫度對柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵的影響

如圖5所示，當發(fā)酵溫度較低時，飲料風味帶有微微酒味，香味比較淡同時滋味較澀，而發(fā)酵溫度較高時，飲料的顏色呈暗黃色，液體中較為渾濁，口味較甜。發(fā)酵溫度為32 ℃時，柑橘紅茶菌飲料的感官評價分值最高，為87.80分，此時柑橘紅茶菌飲料色澤呈橘黃色且清澈透明，酸甜適中，口感細膩潤滑，氣味協(xié)調柔和。發(fā)酵溫度對菌種生長、產(chǎn)酸能力有一定影響。發(fā)酵溫度在32 ℃時，可溶性固形物消耗最大，pH值最低。說明在發(fā)酵溫度32 ℃時，紅茶菌群處于一個活力較好的狀態(tài)，能夠充分利用糖類產(chǎn)生有機酸。這也基本在酵母菌（26～30 ℃）、醋酸菌（28～35 ℃）和乳酸菌（30～37 ℃）的最適生長溫度內[35]。溫度過低或過高時，不利于菌種生長繁殖，同時也降低了產(chǎn)酸能力[36]。根據(jù)Nguyen等[19]的研究，紅茶菌飲料發(fā)酵工藝的正確選擇是能夠生產(chǎn)出健康有機酸含量較高的飲料，pH能反映有機酸含量。因此，從有機酸含量生成的角度，柑橘紅茶菌飲料最佳發(fā)酵溫度選為32 ℃。

表3 配方優(yōu)化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of formula optimization by response surface method

2.2 響應面法優(yōu)化設計與結果

根據(jù)單因素結果可知，柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵過程中，pH值與可溶性固形物消耗量的變化趨勢相反，但基本保持了同步。研究表明，有機酸是紅茶菌飲料獨特風味的主要影響因素，而pH大小可以比較直觀的反映有機酸含量[37]。結合成本考慮，本研究最終以pH值為響應指標，乳酸菌粉添加量、蔗糖濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間4個因素設計響應面試驗，得到二次多項回歸方程：Y=3.14-0.005833A-0.0075B+0.021C-0.027D+0.032AB-0.012AC-0.068AD+0.13BC-0.02BD+0.1CD+0.93A2+0.77B2+0.48C2+0.3D2

2.2.1 方差分析

對回歸方程結果進行方差分析（表4）發(fā)現(xiàn)：響應面回歸模型中F=80.68且p＜0.0001，說明試驗中所采用的二次模型極為顯著；失擬項F=4.46，p=0.0813＞0.05，則說明模型與純誤差之間的關聯(lián)不顯著，該模型具有較高可靠性；模型的決定系數(shù)R2為0.9878，說明模型具有較高顯著性；同時調整決定系數(shù)AdjR2=0.9755，能夠解釋實驗有97.55%符合模型，且預測相關系數(shù)Pred R2=0.9337，說明此實驗模型與真實數(shù)據(jù)擬合程度良好，具有實踐指導意義，由此可以用該模型分析和預測紅茶菌制備的最優(yōu)工藝條件。交互項BC、CD對pH值的影響顯著（p＜0.05），二次項A2、B2、C2、D2對pH值的影響極顯著（p＜0.01）。根據(jù)表中各個因素的F值，說明各變量對pH值影響大小順序為：D（發(fā)酵時間）＞C（發(fā)酵溫度）＞B（蔗糖添加量）＞A（乳酸菌粉添加量）。

表4 擬合回歸方程的方差分析結果Table 4 Analysis of variance of regression equation

2.2.2 響應面交互作用分析

響應面圖中，等高線越密集，響應面越陡峭，則說明該因素對結果的影響越顯著[38,39]。由圖6可知，BC和CD項的響應面比較陡峭，影響顯著（p＜0.05）；且從等高線可以看出，BC和CD的等高線接近于橢圓形，說明兩因素之間交互作用顯著（p＜0.05），即蔗糖添加量和發(fā)酵溫度之間、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間之間的影響顯著；而其他的因素等高線接近圓形，則說明交互作用不顯著?；貧w方程模型的方差分析結果與響應面圖反映的各因素之間的交互作用結果一致。

以上結果可知，以pH值為響應指標，在乳酸菌粉添加量、蔗糖添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等因素共同作用下，柑橘紅茶菌飲料最優(yōu)發(fā)酵工藝為：乳酸菌粉添加量0.40%、蔗糖添加量15.04%、發(fā)酵溫度31.89 ℃、發(fā)酵時間4.05 d，在此條件下模型預測的pH值為3.14。

2.3 最優(yōu)工藝條件試驗驗證

結合生產(chǎn)所能實現(xiàn)的實際條件，取乳酸菌粉添加量0.40%、蔗糖添加量15%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間4 d，進行柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵，三次重復，以驗證響應面優(yōu)化的預測結果。最后得柑橘紅茶菌飲料pH值為3.14，感官評價分值為93.1分，可溶性固形物消耗量為12.30%，紅茶菌飲料液體澄清，色澤呈淺亮的橘黃色，酸甜中帶有著柑橘發(fā)酵的果香和微微的茶香。該值與模型預測結果基本一致，表明基于該響應面模型分析優(yōu)化柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵工藝的方法可行。

3 結論

本研究以新會柑橘和英德紅茶作為主要原料，以乳酸菌、醋酸菌和酵母菌為發(fā)酵劑，對柑橘紅茶菌飲料發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化探究。通過單因素確定了乳酸菌粉添加量、蔗糖添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間，利用Box-Behnken響應面法對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳發(fā)酵工藝條件為：乳酸菌粉添加量0.40%、蔗糖添加量15%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時間4 d，在此工藝條件下，得出柑橘紅茶菌發(fā)酵液pH值為3.14、感官評價分值為93.1分、可溶性固形物消耗量為12.30%。本研究結果為提高英德紅茶和新會柑橘的資源利用率及柑橘紅茶菌飲料開發(fā)提供了理論依據(jù)及技術支持。