近紅外二區(qū)熒光探針的設(shè)計及應(yīng)用研究進展

黃艷芳，李子婧

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，福建 廈門 361102)

光學(xué)成像技術(shù)具有無創(chuàng)、安全、可視化能力強、空間分辨率高、成本低等優(yōu)點，可對生物分子、細胞、組織和生物體進行實時、多維的可視化監(jiān)測，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要研究手段[1-2].熒光成像由于其靈敏度高、分辨率高及操作簡單等優(yōu)點，在生物分子檢測成像、藥物分布代謝跟蹤、疾病檢測和診斷，特別是癌癥早期診斷和影像引導(dǎo)治療中，具有良好應(yīng)用前景.

與可見光相比，發(fā)射波長在近紅外區(qū)域的熒光探針可獲得更深的穿透深度和更好的成像質(zhì)量，因此，近10年來，熒光成像技術(shù)主要集中在近紅外窗口.近紅外一區(qū)(NIR-Ⅰ，700～900 nm)熒光成像以其高靈敏度、快速反饋、無危害輻射、低成本等優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)研究中受到廣泛關(guān)注.例如，利用NIR-Ⅰ熒光染料可以精確地描繪前哨淋巴結(jié)/腫瘤輪廓，并在術(shù)中引導(dǎo)切除前哨淋巴結(jié)/腫瘤組織[3].最近的研究表明，由于具有散射少、組織吸收可忽略和自熒光效應(yīng)最小化等優(yōu)勢，在近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm)進行生物醫(yī)學(xué)成像可以充分提高成像的時空分辨率(約20 ms 和約25 mm)以及穿透深度(高達3 cm)，從而獲得比NIR-Ⅰ更好的圖像質(zhì)量和更高的信背比[4-7].

目前，臨床批準的近紅外熒光染料有兩種，分別是吲哚菁綠(ICG，發(fā)射波長800 nm)和亞甲基藍(MB，發(fā)射波長700 nm)，兩者都是可以快速排泄的小分子，主要用于NIR-Ⅰ成像[2].隨著化學(xué)合成的不斷發(fā)展，新的熒光材料不斷被發(fā)掘.NIR-Ⅱ熒光材料種類也日益豐富，如有機熒光材料、量子點、稀土納米材料等被開發(fā)應(yīng)用于近紅外生物醫(yī)學(xué)成像.然而，缺乏良好的水溶性、穩(wěn)定性、熒光效率和生物相容性等是NIR-Ⅱ熒光材料發(fā)展的瓶頸.如何解決這些問題是NIR-Ⅱ熒光成像領(lǐng)域的熱點，也是未來發(fā)展方向[8-12].因此，開發(fā)熒光效率高、水溶性好、生物相容性好的新型NIR-Ⅱ熒光材料，對熒光成像技術(shù)的發(fā)展具有重要意義.本文對近期新型NIR-Ⅱ熒光材料的設(shè)計理念及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進行綜述和展望，以期為NIR-Ⅱ熒光成像技術(shù)的發(fā)展提供參考思路.

1 有機NIR-Ⅱ熒光探針

目前，已經(jīng)開發(fā)出多種性能優(yōu)良的有機NIR-Ⅱ熒光材料，其具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并且易于代謝，生物相容性好[13]，因此極具吸引力和發(fā)展前景，有望率先在未來的臨床中應(yīng)用.

1.1 苯并雙噻二唑(BBTD)類

具有供體-受體-供體(D-A-D)特征的熒光團，如BBTD衍生物，具有較大的斯托克斯位移(約200 nm)和高成像質(zhì)量.在D-A-D支架中，強電子供體與中心電子受體的空間結(jié)構(gòu)可縮小雜化最高占據(jù)分子軌道(HOMO)與最低未占據(jù)分子軌道(LUMO)能級之間的能隙，將熒光發(fā)射波長紅移至NIR-Ⅱ窗口[13-16].BBTD通過調(diào)節(jié)D-A-D熒光團的受體和供體結(jié)構(gòu)可以有效地改變吸收和發(fā)射光譜特征.

通常，BBTD基熒光團的最大吸收波長和發(fā)射波長分別位于800和1 000 nm左右，波長相對較短.設(shè)計波長更長的新型熒光團將有利于在NIR-Ⅱ?qū)ι顚咏M織進行成像[17].Fang等[18]研究后發(fā)現(xiàn)：用Se原子取代BBTD骨架中的S原子可以使發(fā)射波長紅移，引入給電子氨基也可以使發(fā)射波長延長至NIR-Ⅰ；但是單一的改進措施只能使波長紅移≤50 nm，如何進一步有效延長波長仍然是一項挑戰(zhàn).通過同時在BBTD骨架中引入一個Se原子和一個氨基，開發(fā)了一種最大發(fā)射波長為1 210 nm的新型有機小分子熒光團FM1210；與S取代的類似物CF1065相比，F(xiàn)M1210的發(fā)射波長大幅紅移了145 nm，并保持相當?shù)牧孔赢a(chǎn)率和亮度，從而使FM1210的活體成像質(zhì)量明顯高于CF1065，波長增益約為使用單一修飾的BBTD衍生物(約50 nm)的3倍，超過1 200 nm區(qū)域波長的大幅增加可歸因于Se原子和氨基的協(xié)同作用.這些優(yōu)點進一步使NIR-Ⅱ熒光探針能夠以100幀/s的速度對小鼠進行成像.此外，該研究還證明納米尺度的FM1210脂質(zhì)體(FM1210-NPs)能以高信背比對腫瘤及血管系統(tǒng)進行活體成像(圖1).

圖1 FM1210的結(jié)構(gòu)(a)及其脂質(zhì)體用于血管及腫瘤的熒光成像(b)[18]

揭示BBTD基熒光團的分子結(jié)構(gòu)與光學(xué)行為之間的關(guān)系，也有助于開發(fā)具有長波長熒光發(fā)射的探針.為此，Ye等[19]研究了BBTD核心兩側(cè)的共軛橋和電子供體對光學(xué)行為的影響：當將苯基噻吩共軛橋(如PT、PPT和PTT)置于BBTD核心兩側(cè)時，它們的吸收波長在640～860 nm區(qū)域，而其發(fā)射波長約1 070 nm；當加入噻吩橋(TPAT)時，吸收和發(fā)射波長分別可達920和1 150 nm.在芴吡咯(FP)官能團存在的情況下，由于吡咯的NH基團與BBTD的氮原子之間形成了分子內(nèi)氫鍵，吸收波長可達1 020 nm，發(fā)射波長超過1 200 nm.這些結(jié)果表明，TPAT和電子供體是延長熒光團吸收和發(fā)射波長的關(guān)鍵成分.基于此，選擇TPAT和苯乙烯來放大共軛橋，以N，N-二甲基氨基作為電子供體，將它們整合到BBTD支架中，從而得到在942 nm處有一個很強的吸收峰、在1 302 nm處有一個發(fā)射峰的目標分子BBTD-1302.1 302 nm 處的最大發(fā)射峰不僅有助于解決更深層腫瘤的成像問題，還避免了使用長通濾波器時熒光成像的亮度下降[13].接著以聚乙二醇(PEG)化表面活性劑對其進行功能化形成水分散性納米粒子BBTD-1302NPs，并通過體外研究驗證了BBTD-1302NPs的高生物相容性和耐光降解性；基于BBTD-1302NPs的良好性能，在荷瘤裸鼠體內(nèi)對BBTD-1302NPs的光熱治療能力進行了研究，結(jié)果顯示經(jīng)尾靜脈注射BBTD-1302NPs和980 nm激光照射的小鼠腫瘤生長受到抑制.

為了改善NIR-Ⅱ熒光量子產(chǎn)率，目前還開發(fā)出多種具有屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元(S-D-A-D-S)結(jié)構(gòu)的熒光團.引入屏蔽單元可以保護熒光團的共軛骨架免受分子間相互作用，從而提高量子產(chǎn)率；同時，供體單元也有助于改善S-D-A-D-S熒光團在水溶液中的量子產(chǎn)率性能.例如：使用3，4-乙二氧基噻吩(EDOT)代替噻吩作為供體單元，可以使熒光探針水溶液中的量子產(chǎn)率從0.002%指數(shù)級增加到0.2%(將熒光團IR-26在二氯乙烷中的量子產(chǎn)率0.05%作為參比測定得出)；具有增強疏水性的3-辛基噻吩進一步作為熒光團IR-FTAP的第一供體，在水中的量子產(chǎn)率提高到0.53%[20].盡管這種供體修飾可有效改善水溶液中的量子產(chǎn)率，但也會引起共軛主鏈更大的畸變，從而導(dǎo)致吸收光譜移動，發(fā)射波長減小，吸收系數(shù)降低.因此，為有效改善熒光團的亮度，在提高量子產(chǎn)率的同時應(yīng)不犧牲吸收系數(shù).基于此，Ma等[21]設(shè)計并合成了以二辛基鏈取代的3，4-丙基二氧基噻吩(PDOT)為供體單元的新型S-D-A-D-S NIR-Ⅱ熒光團IR-FP8P，以增強量子產(chǎn)率和吸收系數(shù)；與IR-FTAP的3-辛基噻吩相比，PDOT供體的共軛主鏈扭曲較小，因此IR-FP8P實現(xiàn)了吸收光譜的紅移和吸收系數(shù)的提高.此外，二辛基鏈取代的PDOT能很好地保護主鏈不與水相互作用，量子產(chǎn)率明顯提高.結(jié)果顯示：IR-FP8P在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率為0.60%，在水溶液中的峰值吸收系數(shù)為1.3×104L/(mol·cm);與IR-FTAP相比，亮度(808 nm激發(fā))增加了5.7倍以上.IR-FP8P可在1 300 nm長通濾波器下對小鼠后肢血管進行成像，并觀察到清晰的血管網(wǎng)絡(luò)，信背比約為7.此外，通過偶聯(lián)卵泡刺激素(FSH)制備具有靶向能力的FSH@FP8熒光探針，可用于小鼠卵巢成像.

大多熒光分子探針在聚集態(tài)時，會由于平面結(jié)構(gòu)分子間強π-π相互作用誘導(dǎo)熒光猝滅(ACQ)效應(yīng)，在水溶液或生理條件下熒光亮度降低，從而限制了其生物成像質(zhì)量.Mei等[22]和Liu等[23]發(fā)現(xiàn)了與ACQ相反的聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)現(xiàn)象，即處于聚集狀態(tài)的熒光探針強度遠高于分散態(tài).因此，當賦予NIR-Ⅱ熒光材料AIE特性，它將具有更高的熒光效率和光穩(wěn)定性，同時大幅提升成像清晰度和分辨率.近期，Li等[24]以BBTD為電子受體、三苯胺(TPA)為電子供體，利用AIE活性分子轉(zhuǎn)子，設(shè)計并合成了PEG化SA-TTB-PEG100；通過自組裝技術(shù)獲取了納米顆粒(粒徑為35 nm)，在約1 050 nm處表現(xiàn)出最大熒光發(fā)射峰，在水中的最高量子產(chǎn)率為10.30%.此外，該自組裝的納米顆粒相比于通過兩親性聚合物包裹的對應(yīng)物，表現(xiàn)出更小的多分散指數(shù)(PDI)、更好的均一性以及更久的膠體穩(wěn)定性，在生物成像方面具有更好的潛力.接著，利用此納米探針在小鼠和兔模型中評估了這種AIE納米顆粒的近紅外熒光成像性能，結(jié)果顯示，NIR-Ⅱ熒光成像在體分辨率約38 μm，穿透深度約1 cm.該研究表明，高效自組裝策略設(shè)計的NIR-Ⅱ AIE納米顆粒對血管相關(guān)疾病的診斷和治療具有重要意義，為NIR-Ⅱ熒光成像技術(shù)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供了新機會.

1.2 花菁類

基于聚次甲基骨架的花菁染料含有擴展π共軛體系，具有獨特的共軛骨架結(jié)構(gòu).通過加長聚次甲基鏈、增加雜環(huán)供體強度，或?qū)㈦s原子從氧改變?yōu)槠渌蜃逶氐确椒?，可以使染料的吸收波長紅移.與D-A-D型染料相比，花菁類染料合成過程相對簡單，吸收強度較高(ε>105L/(mol·cm))，特別是對近紅外光有很強的吸收，因此很適合于近紅外成像[25-26].

由于循環(huán)時間短，菁類染料為血管成像提供的成像時間窗口通常小于2 min.將染料與蛋白質(zhì)進行生物結(jié)合可以增強循環(huán)時間，但這可能會產(chǎn)生猝滅效應(yīng)而犧牲亮度.因此，需要發(fā)展一種新策略，在改善藥代動力學(xué)特征的同時，又能確保NIR-Ⅱ熒光團的高量子產(chǎn)率.Tian等[27]通過牛血清白蛋白(BSA)和花菁染料之間的工程化超分子組裝，開發(fā)了一個自組裝的、尺寸約為50 nm的IR-783@BSA.該復(fù)合物可以保持扭曲的構(gòu)象，且IR-783與白蛋白之間的納摩爾級結(jié)合親和力增強了扭曲的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)過程和循環(huán)時間；循環(huán)時間增強使IR-783@BSA能夠在注射后3 h內(nèi)觀測到3 μm寬的血管，同時具有超高的對比度，從而獲得高質(zhì)量的NIR-Ⅱ成像.

目前，NIR-Ⅱ花菁類染料在生物成像中存在穩(wěn)定性差、斯托克斯位移小，或發(fā)生溶劑化猝滅等缺點.針對這些問題，Ren等[28]通過理性設(shè)計和理論計算相結(jié)合，提出構(gòu)建NIR-Ⅱ熒光染料的新思路，即增大空間位阻和電子不對稱性，并以此開發(fā)了一系列穩(wěn)定、高量子產(chǎn)率、抗溶劑化猝滅的新型菁熒光團(NIRⅡ-RTs)，其在水溶液中的吸收和發(fā)射峰分別高達977和1 008 nm.與傳統(tǒng)的NIR-Ⅱ七甲川菁相比，NIRⅡ-RTs具有較小的斯托克斯位移和對溶劑極性敏感的吸收帶，在極性溶劑中表現(xiàn)出穩(wěn)定且強烈的吸收.穩(wěn)定性測試表明，NIRⅡ-RTs在生理環(huán)境中的化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性均優(yōu)于商用七甲川菁類似物IR1061和吲哚菁綠.這些特點使NIRⅡ-RTs在生物成像應(yīng)用中具有優(yōu)異的高亮度和深層組織穿透性.此外，由于引入了羧酸官能團，新型染料NIRⅡ-RT3/4可以通過螺旋環(huán)化作用產(chǎn)生一個強大的熒光開關(guān)機制，所以NIRⅡ-RT染料可以設(shè)計作為可激活的NIR-Ⅱ熒光探針.作為概念的證明，該團隊應(yīng)用NIRⅡ-RT4構(gòu)建了一系列可靶向激活的NIR-Ⅱ熒光探針(NIRⅡ-RT-pH、NIRⅡ-RT-三磷酸腺苷(ATP)和NIRⅡ-RT-Hg)，用于生物相關(guān)物質(zhì)的檢測.特別是利用NIRⅡ-RT-ATP探針，首次實現(xiàn)了高對比度藥物性肝損傷小鼠肝臟ATP含量的實時監(jiān)測.

通常，有機熒光染料僅通過結(jié)構(gòu)修飾很難將最大吸收波長和發(fā)射波長紅移至1 300 nm以上，而J-聚集體可以使單個分子的吸收和發(fā)射波長紅移，吸收系數(shù)增強且斯托克斯位移減小.因此，為了獲取更長吸收和發(fā)射波長的NIR-Ⅱ探針，最近Sun等[29]通過自組裝FD-1080花菁染料和1，2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)，成功開發(fā)了一種新型的NIR-Ⅱ探針FD-1080 J-聚集體，其在生理條件下表現(xiàn)出較高的親水性和穩(wěn)定性，最大吸收和發(fā)射波長均超過1 300 nm；進一步利用分子動力學(xué)模擬研究了磷脂DMPC與FD-1080在J-聚集體形成過程中的相互作用；此外，還對FD-1080 J-聚集體進行了1 500 nm以上的光學(xué)成像(圖2)，并成功用于監(jiān)測高血壓大鼠在給藥后頸動脈的動態(tài)變化，以評價降壓藥的療效.

圖2 浸沒于不同深度甘油中的J-聚集體的熒光圖像(a)，不同成像窗口中在穿透深度處J-聚集體的半峰寬(FWHM)(b)及注射J-聚集體后在不同區(qū)域獲得的腦和后肢血管圖像(c)[29]

1.3 硼二吡咯烷(BODIPY)類

BODIPY染料具有高的量子產(chǎn)率、優(yōu)異的化學(xué)和光物理穩(wěn)定性，在分子成像和藥物傳遞方面發(fā)揮著重要作用[30-31].經(jīng)典的BODIPY吸收范圍為500～600 nm，并且具有相當小的斯托克斯位移(15～30 nm).基于BODIPY的強吸電子性質(zhì)，引入給電子基團可促使吸收和發(fā)射波長紅移.例如，Mcdonnel等[32]在3，5-位將己二甲胺基引入苯環(huán)，可使其在三氯甲烷溶液中吸收和發(fā)射光譜的峰值分別從650和672 nm顯著紅移到799和823 nm.近年來，基于BODIPY的NIR-Ⅱ型有機熒光材料也得到了迅速的發(fā)展.

氮雜BODIPY(aza-BODIPY)的水溶性較差，限制了它們在活體研究中的應(yīng)用.為了解決該問題，Godard等[33]采用了一種新策略，通過在硼原子上引入銨基，制備出水溶性aza-BODIPY，命名為SWIR-WAZABY-01.無需親水性包封或PEG輔助，SWIR-WAZABY-01可直接用于腫瘤的NIR-Ⅱ成像(圖3).這種以aza-BODIPY為基礎(chǔ)的染料可以在腫瘤中迅速到達和累積，并在體內(nèi)保留長達1周.

圖3 SWIR-WAZABY-01的結(jié)構(gòu)及其用于腫瘤的熒光成像[33]

最近，Bai等[34]利用分子工程開發(fā)出一系列新的aza-BODIPY染料：NJ960、NJ1030和NJ1060.與經(jīng)典的aza-BODIPY相比，該類分子在強D-A分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)的幫助下可將近紅外發(fā)射光譜紅移到NIR-Ⅱ.此外，該類染料具有很好的光物理性能，如斯托克斯位移大、光穩(wěn)定性好、水溶液中熒光亮度大等，其中NJ-1060在NIR-Ⅱ熒光量子產(chǎn)率高達1.00%，并且體內(nèi)NIR-Ⅱ熒光成像結(jié)果表明NJ-1060具有高分辨率和深穿透成像能力.

1.4 基于共軛聚合物的NIR-Ⅱ染料

富電子供體和吸電子受體可使共聚物的帶隙變小，因此通過D-A交替共聚生成的共軛聚合物具有帶隙小、易調(diào)整的優(yōu)點，是NIR-Ⅱ探針設(shè)計的一種有效途徑.半導(dǎo)體聚合物點(Pdots)是近年來出現(xiàn)的一種新型有機熒光材料.與傳統(tǒng)熒光染料相比，Pdots具有寬吸收、對稱窄發(fā)射、高光亮度、高光穩(wěn)定性及大斯托克斯位移.因此，高熒光Pdots組成的納米顆粒被視為一種有效的熒光探針[35-36]，在生物成像、分子檢測、指導(dǎo)藥物治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景.

盡管Pdots由于其可調(diào)的光學(xué)特性，在生物成像和生物傳感方面具有很強的實用價值，但是與有機溶劑中的原始聚合物相比，納米粒子形式的半導(dǎo)體聚合物通常表現(xiàn)出熒光猝滅，可歸因于鏈間和鏈內(nèi)π-π堆積的強相互作用，從而導(dǎo)致非發(fā)射性激子和激基復(fù)合物的形成[37-38].隨著發(fā)射能量的降低，無輻射衰減率顯著增加，很難獲得高量子產(chǎn)率的NIR-Ⅱ熒光團.最近，Zhang等[39]提出了一種雙重熒光增強機制來增強Pdots的NIR-Ⅱ熒光，通過分子工程策略開發(fā)了9種NIR-Ⅱ半導(dǎo)體聚合物.在該研究中，一方面利用吩噻嗪單元的聚集誘導(dǎo)發(fā)射特性來減少聚集態(tài)聚合物的非輻射衰變路徑；另一方面引入了大量的側(cè)鏈基團，通過空間位阻來減弱鏈間和鏈內(nèi)π-π堆積產(chǎn)生的強相互作用，進一步增強熒光量子產(chǎn)率.基于這種雙重增強策略制備的P3cPdots在水溶液中的熒光量子產(chǎn)率約為1.70%，比四氫呋喃溶液中的原始聚合物增強約21倍.活體小鼠頭蓋部熒光成像有顯著改善，表明這種雙重增強策略在設(shè)計活體熒光成像的NIR-Ⅱ熒光團方面具有潛在應(yīng)用前景.

另外，針對Pdots在水溶液中往往會出現(xiàn)嚴重的熒光猝滅問題，Liu等[40]通過在聚合物受體的不同位置引入氟原子，利用分子調(diào)控NIR-Ⅱ熒光增強策略，減少聚合物與水分子的相互作用和非輻射越躍，從而提高NIR-Ⅱ熒光量子效率(圖4).分別以苯并二噻吩(BDT)和三唑[4,5-g]-喹喔啉(TQ)衍生物為供體和受體，設(shè)計了兩種含氟半導(dǎo)體聚合物.光物理實驗結(jié)果顯示：在808 nm光激發(fā)下，聚合物發(fā)射光譜覆蓋了NIR-Ⅱ，肩峰延伸超過1 300 nm；隨著氟化程度的加深，聚合物發(fā)射光譜紅移.隨后利用密度泛函理論表明氟化使激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間的結(jié)構(gòu)畸變減小，從而減少了非輻射弛豫，增強了Pdots的熒光量子產(chǎn)率.最后用Pdots進行小鼠顱骨腫瘤血管系統(tǒng)的活體熒光成像，獲取了一系列高穿透深度和高信背比的熒光圖像.

圖4 納米尺度氟化效應(yīng)的示意圖[40]

各種有機NIR-Ⅱ熒光探針的關(guān)鍵參數(shù)和應(yīng)用總結(jié)于表1.

表1 有機NIR-Ⅱ熒光探針的比較

2 無機NIR-Ⅱ熒光探針

與NIR-Ⅱ有機小分子染料相比，NIR-Ⅱ納米探針具有相對較高的量子產(chǎn)率和較低的光漂白敏感性，在肝臟、腎臟、大腦和肺成像等領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢.目前，已開發(fā)如稀土納米粒子(RENPs)、量子點(QDs)、金納米團簇(AuNCs)、單壁碳納米管(SWNTs)等材料作為NIR-Ⅱ探針[41-43].在此，介紹基于無機材料的NIR-Ⅱ熒光探針的開發(fā)及其在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用，并重點關(guān)注近期新型無機NIR-Ⅱ熒光探針的研究進展.

2.1 稀土納米材料

RENPs具有較大的斯托克斯位移、較小的光漂白、狹窄和多峰值的發(fā)射特性以及可忽略的激發(fā)-發(fā)射帶重疊，因此受到越來越多的關(guān)注.此外，由于可通過摻雜不同的稀土金屬離子來調(diào)諧發(fā)射波長和延長發(fā)光壽命[43-45]，RENPs成為NIR-Ⅱ熒光成像的研究熱點，有著很廣泛的應(yīng)用前景.

由于具有很長的熒光壽命(ms級別)以及很大的斯托克斯位移(≥200 nm)，鑭系RENPs作為熒光探針被廣泛使用.最近，Li等[46]以77.5∶20.0∶2.5的摩爾比混合1,2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、膽固醇(Chol)和聚乙二醇化脂質(zhì)(DSPE-PEG2000)合成脂質(zhì)體，然后使用該脂質(zhì)體進一步包覆NIR-Ⅱ鑭系熒光基團RENPs，得到在1 064和1 345 nm處雙發(fā)射、大斯托克斯位移(分別為264和545 nm)的RENPs@Lips.RENPs@Lips在1 064 nm處的量子產(chǎn)率為7.90%，在808 nm激發(fā)下1 345 nm處的量子產(chǎn)率為4.10%.此外，RENPs@Lips顯著增強了靜脈排泄性和膠體穩(wěn)定性，縮短了在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的停留時間，并且超過90%的RENPs@Lips靜脈給藥后72 h內(nèi)可以從肝臟排出.與之前報道的RENPs@DSPE-mPEG相比，RENPs@Lips的體內(nèi)清除速度快且半衰期短；同時，未發(fā)現(xiàn)明顯的RENPs@Lips骨積聚，這有助于減少骨系統(tǒng)滯留和加速靜脈清除.這些結(jié)果表明RENPs@Lips具有良好的生物相容性、靜脈內(nèi)排泄性和優(yōu)異的光化學(xué)性質(zhì)，適合于臨床前評估和監(jiān)測生理和病理過程，可促進其未來的臨床轉(zhuǎn)化.

據(jù)報道，稀土元素Yb/Er共摻雜納米顆粒(ErRENPs)具有NIR-Ⅱ波長的發(fā)光特性，并表現(xiàn)出斯托克斯位移大(高達450 nm)、壽命長、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點，被認為是新一代近紅外探針的優(yōu)異候選者.然而，Er3+容易發(fā)生能量轉(zhuǎn)移到納米晶體表面的現(xiàn)象，導(dǎo)致嚴重的熒光猝滅.最近，Cao等[47]采用Nd3+敏化Yb3+的體系，在內(nèi)部Ce3+的輔助下將能量轉(zhuǎn)移到發(fā)光中心Er3+上.該研究中，在內(nèi)核中摻雜Er3+作為激活劑，并在核心層和中間層混合Yb3+作為敏化劑，之后在NaYbF4:Er核納米晶中進一步摻雜Ce3+以增強NIR-Ⅱ發(fā)射，并通過調(diào)節(jié)摻雜離子來優(yōu)化納米粒子的發(fā)光性能.引入PEG配體提高了納米顆粒的水溶性(圖5)，實現(xiàn)了較長的血液循環(huán)時間.通過采集其NIR-Ⅱ熒光信號，該納米探針可用于腫瘤的高分辨率追蹤和成像.

UCL.上轉(zhuǎn)換熒光.

2.2 QDs

QDs具有寬激發(fā)光譜、窄發(fā)射光譜、高量子產(chǎn)率、抗光漂白等優(yōu)點，在活體生物成像中具有很高的時空分辨率，因此引起了人們的廣泛關(guān)注.已有研究通過對PbS、CdSe、Ag2S等QDs的尺寸和形狀進行微調(diào)，可以調(diào)節(jié)其藥代動力學(xué)和組織分布[48-49].

PbS QDs具有多種獨特的特性，包括窄帶隙、大玻爾半徑、在近紅外區(qū)可調(diào)諧和強發(fā)射，使其廣泛應(yīng)用于光電子器件、傳感器和活體成像等領(lǐng)域[48].目前膠體法制備窄粒徑PbS QDs的方法已得到很好的發(fā)展，但在較高的溫度下，該方法制備的納米晶很不穩(wěn)定.此外，由于表面易被氧化，其光學(xué)性質(zhì)對空氣和水相當敏感，限制了它們在生物成像中的應(yīng)用.Shi等[51]通過陽離子摻雜工藝，制備了一系列高質(zhì)量的鋅摻雜PbS QDs，發(fā)現(xiàn)鋅摻雜后可以形成摻雜態(tài)，降低了主體PbS的能隙，有效增強了PbS QDs的量子產(chǎn)率和光致發(fā)光壽命，并改善了QDs在高溫下的熒光穩(wěn)定性.這種陽離子摻雜策略為制備波長更長的更小粒子提供了一種新方案，可批量制備一系列波長覆蓋整個NIR-Ⅱ的高質(zhì)量QDs，為近紅外光學(xué)成像提供了新工具；同時，PEG化的QDs可用于活體小鼠的腦血管無創(chuàng)高分辨熒光成像，實現(xiàn)了在毛細血管水平上高分辨率的腦血管無創(chuàng)近紅外成像.

2.3 惰性金屬納米材料

惰性金屬基(如Au和Pt)發(fā)射體不易引起熒光猝滅，因此很適用于NIR-Ⅱ成像.AuNCs是其中一個典型的代表，其具有比腎臟排泄閾值更小的尺寸、良好的光穩(wěn)定性、易于修飾、優(yōu)異的光熱活性和多樣性等多種獨特優(yōu)勢，因此成為極具發(fā)展前景的新型NIR-Ⅱ 探針[52-53].考慮到胃腸道的酸性和酶生物環(huán)境可能會導(dǎo)致大多數(shù)納米發(fā)射體的熒光猝滅，Wang等[54]提出合成惰性金屬基發(fā)射體用于胃腸道近紅外成像，以克服潛在的熒光猝滅問題.通過構(gòu)建核糖核酸酶-A(RNase-A，由巰基和芳香族氨基酸組成)封裝AuNCs，得到具有一個完美高斯型發(fā)射峰的RNase-A@AuNCs，峰中心位于1 050 nm，F(xiàn)WHM約為205 nm，與大多數(shù)報道的新型金屬基成像劑相比，該發(fā)射峰相對狹窄，且RNase-A@AuNCs的量子產(chǎn)率為1.90%.將RNase-A@AuNCs暴露于胃腸道模擬液和哺乳動物細胞中以評估其穩(wěn)定性和生物安全性，結(jié)果表明RNase-A@AuNCs具有高穩(wěn)定性和良好的生物相容性.與兩個已報告的近紅外發(fā)射體(Ag2S和NaYF4:Er/Yb)相比，RNase-A@AuNCs胃腸道靈敏度提高了50倍以上.該研究首次將蛋白電暈技術(shù)應(yīng)用在AuNCs上，將激發(fā)波長紅移到NIR-Ⅱ，并使用一個腸癌模型來證明AuNCs作為腫瘤診斷顯像劑的潛在效用.

近期，Li等[55]合成了粒徑3.3 nm左右的具有25個Au原子和18個肽配體的新型AuNCs,即Au25(SG)18，可在NIR-Ⅱ發(fā)射.由于天冬氨酸和亞氨基二乙酸等羧酸可以作為天然骨靶向配體，研究人員假設(shè)Au25(SG)18中豐富的羧酸側(cè)鏈能使其與骨結(jié)合，從而作為一種新型的骨顯像NIR-Ⅱ探針.該研究首次發(fā)現(xiàn)Au25(SG)18與羥基磷灰石具有良好的體外結(jié)合能力.通過結(jié)合Au25(SG)18，NIR-Ⅱ熒光成像能高分辨率和高對比度地描繪出體內(nèi)骨結(jié)構(gòu)，并探討了以Au25(SG)18作為骨組織術(shù)中NIR-Ⅱ熒光導(dǎo)航的潛在價值.

除具有NIR-Ⅱ成像能力外，帶裸Au原子的AuNCs還可通過形成Au—S共價鍵與某些含巰基的物種如谷胱甘肽(GSH)發(fā)生反應(yīng)[56].Yang等[57]開發(fā)出一種雙功能的熱釋光納米藥物(AuNCs-Pt)，利用AuNCs來遞送Pt(Ⅳ)(圖6).一方面，AuNCs-Pt的NIR-Ⅱ成像能力保證了高分辨率的腫瘤深部模型中Pt轉(zhuǎn)運的有效可視化；另一方面，AuNCs-Pt通過Au—S鍵來結(jié)合GSH，以清除胞內(nèi)GSH，從而有效地使腫瘤細胞對Pt類藥物敏感.結(jié)果表明，AuNCs-Pt能夠消除高危害的深部腫瘤，并減輕人體來源的肝癌異種移植的腫瘤負擔.因此，AuNCs-Pt作為一種診療一體化納米藥物，在最大限度利用Pt依賴性化療的同時，可通過高分辨率NIR-Ⅱ成像來監(jiān)測Pt在深部組織中的運輸.

EDC.1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽;NHS.N-羥基琥珀酰亞胺;HCC.肝細胞癌.

2.4 SWCNTs

SWCNTs直徑約為1 nm，長度為幾百至幾千納米，在分散劑的幫助下可溶解在水溶液中.SWCNTs的斯托克斯位移較大，在近紅外波段具有良好的光穩(wěn)定性和熒光發(fā)射，長期作為光學(xué)生物傳感器.此外，得益于良好的光熱轉(zhuǎn)化效率和光敏特性，SWCNTs已廣泛應(yīng)用于光熱和光動力療法.近年來，由于其固有的寬NIR-Ⅱ熒光發(fā)射，SWCNTs越來越多地用于體內(nèi)成像.例如，Welsher等[58]將SWCNTs作為第一代NIR-Ⅱ熒光探針應(yīng)用于活體熒光成像，并在NIR-Ⅱ獲得了更深層的組織穿透力和更高的時間和空間分辨率(<300 ms，約10 μm).此外，SWCNTs還應(yīng)用于高性能血流動力學(xué)成像、全身血液循環(huán)和淋巴系統(tǒng)跟蹤、腫瘤手術(shù)指導(dǎo)等領(lǐng)域[59].

由于NIR-Ⅱb(1 500～1 700 nm)具有最低的光散射，所以在NIR-Ⅱb進行活體生物成像能提供更高的空間分辨率、更深的組織穿透以及更好的信背比.目前，大多數(shù)基于高壓一氧化碳轉(zhuǎn)化(HiPCO)的NIR-ⅡSWCNTs直徑分布為0.7～1.1 nm，熒光發(fā)射范圍為1 000～1 400 nm[60-61]；而具有更大直徑的SWCNTs能夠在更長波長區(qū)域?qū)崿F(xiàn)高分辨率的熒光成像.最近，Diao等[62]通過激光氣化(LV)合成了平均直徑范圍為0.96～1.24 nm的NIR-Ⅱ發(fā)射體SWCNTs，在LV合成過程中將爐溫從950 ℃升高至1 125 ℃，使SWCNTs的平均直徑從約0.9 nm變?yōu)?.4 nm.與先前廣泛使用的HiPCO-SWCNTs相比，由于帶隙較小和平均直徑較大，LV SWCNTs在NIR-Ⅱb顯示出更高的熒光.利用該SWCNTs作為體內(nèi)NIR-Ⅱb熒光造影劑，發(fā)現(xiàn)小鼠后肢和大腦(顱骨和頭皮完整)的活體血管成像的空間分辨率約4 mm，深度可達3 mm.

SWCNTs的體內(nèi)潛在毒性問題是其臨床轉(zhuǎn)化的一大障礙，為了克服該問題，Takeuchi等[63]利用磷脂PEG包裹摻氧的SWCNTs得到O-SWCNT-PEG，并研究O-SWCNT-PEG給藥后的生物反應(yīng).在980 nm光激發(fā)下O-SWCNT-PEG可以發(fā)射1 300 nm的NIR-Ⅱ熒光，適合用于體內(nèi)NIR-Ⅱ熒光成像;將O-SWCNT-PEG經(jīng)靜脈注射到活體小鼠體內(nèi)，作為血管成像的對比劑，研究了造影探針在體內(nèi)的滯留時間、生物分布、毒性等生物學(xué)特征(圖7).結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾靜脈注射后，O-SWCNT-PEG在血管內(nèi)循環(huán)時間約為3 h，大部分在1 d內(nèi)從體內(nèi)清除.此外，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對主要代謝物和脂質(zhì)代謝進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗動物的免疫反應(yīng)可忽略不計，并且?guī)缀跛猩飿擞浳镌诮o藥1個月后恢復(fù)到正常值.該研究表明O-SWCNT-PEG是一種生物相容性良好的探針，有效克服了SWCNTs的毒性問題，可用于NIR-Ⅱ波長范圍內(nèi)的血管造影成像.

(a)注射30 μg O-SWCNT-PEG后的小鼠活體成像；(b)血液和肝臟隨時間變化的熒光強度；(c)給藥后肝臟、脾臟、肺、腎和心臟的離體熒光成像.

各種無機NIR-Ⅱ熒光材料的關(guān)鍵參數(shù)和應(yīng)用總結(jié)于表2.

表2 無機NIR-Ⅱ熒光探針的比較

3 展 望

有機NIR-Ⅱ材料通過調(diào)節(jié)分子結(jié)構(gòu)可以有效地優(yōu)化光譜學(xué)性質(zhì)，并且易降解，生物毒性小，在體內(nèi)成像應(yīng)用方面具有很大的潛力.花菁類NIR-Ⅱ熒光團合成過程相對簡單，通過延長聚次甲基鏈、增加雜環(huán)的供體強度，可使發(fā)射波長紅移.D-A-D型生色團具有較大的斯托克斯位移(約200 nm)和較高的成像質(zhì)量，在1 000 nm 以上具有優(yōu)異的光致發(fā)光和電致發(fā)光性能，并且通過調(diào)節(jié)D-A-D熒光團的受體和供體結(jié)構(gòu)，可以有效地改變吸收和發(fā)射光譜特征.值得注意的是，上述兩類小分子染料具有生物相容性好、循環(huán)時間短、體內(nèi)代謝快等優(yōu)點，避免了長期毒性問題；但存在量子產(chǎn)率較低、水溶性和生物體內(nèi)穩(wěn)定性較差等不足，往往需要通過改造來提高水溶性，例如將小分子染料包裹在聚合物基質(zhì)中，但這大大增加了它們的大小，超過40 ku的腎臟清除閾值.因此，需通過合理的策略以消除上述障礙.共軛聚合物具有高度離域的π-共軛主鏈和可配置的側(cè)鏈，這賦予了它們可調(diào)節(jié)的光物理性質(zhì)和多功能性.此外，共軛聚合物通常具有吸收系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點，但尚存在分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)不確定性等問題.總體而言，有機NIR-Ⅱ熒光團具有優(yōu)良的光學(xué)性能、良好的生物相容性、較低的毒性等特點，并且其理化性質(zhì)可通過結(jié)構(gòu)修飾來調(diào)節(jié)，因此在未來臨床中具有很大的應(yīng)用前景.

近年來，國內(nèi)外科學(xué)家開發(fā)出一系列性能優(yōu)異的無機NIR-Ⅱ熒光納米探針.與小分子熒光體相比，無機納米熒光體如QDs和AuNCs，顯示出較高的量子產(chǎn)率和較低的光漂白敏感性，常被用于肝臟、腎臟、大腦和肺成像；然而這些材料容易在肝/脾部位滯留和積累，不易被機體排泄.SWCNTs在NIR-Ⅱ具有強熒光性，能實現(xiàn)深層組織穿透和高空間分辨率熒光成像；但是其溶解度和生物相容性較差，這導(dǎo)致在表面改性之前無法直接用于生物成像.RENPs由于其大斯托克斯位移、窄和多峰的發(fā)射光譜、可忽略的激發(fā)-發(fā)射帶重疊以及優(yōu)異的光穩(wěn)定性而受到越來越多的關(guān)注；但是與大多數(shù)報道的NIR-Ⅱ 無機納米材料一樣，在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中滯留時間長和無法從活體清除增加了其潛在的安全隱患，是未來生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和轉(zhuǎn)化中不可忽視的障礙.

與傳統(tǒng)的NIR-Ⅰ成像技術(shù)和其他醫(yī)學(xué)成像方法相比，NIR-Ⅱ生物成像技術(shù)不僅成像深度更深，而且可以更好地避免組織自發(fā)熒光和光子散射等背景干擾.目前，已經(jīng)成功合成和制備了有機小分子材料、共軛聚合物、無機納米材料(稀土納米材料、半導(dǎo)體QDs和SWCNTs)等多種NIR-Ⅱ材料.NIR-Ⅱ材料由于其獨特的優(yōu)異性，不僅可以作為生物醫(yī)學(xué)造影劑，而且可用于光熱和光動力治療、藥物遞送、手術(shù)指導(dǎo)和移植干細胞的跟蹤等領(lǐng)域.

本文概述了新型NIR-Ⅱ熒光材料的設(shè)計思路及其多樣化的生物應(yīng)用.雖然NIR-Ⅱ熒光材料的發(fā)展豐富了人們對NIR-Ⅱ生物成像領(lǐng)域的認識和應(yīng)用，但是目前的工作主要集中在基礎(chǔ)研究上，在臨床上的應(yīng)用還有很長的路要走.總體來說，NIR-Ⅱ熒光材料的開發(fā)設(shè)計要考慮以下幾點：首先，最值得關(guān)注的問題是，生物相容性差及潛在的生物毒性可能會對人體生理功能產(chǎn)生影響，損害人體健康；其次，NIR-Ⅱ熒光材料的熒光量子產(chǎn)率低、發(fā)射波長短、化學(xué)合成過程繁瑣耗時等缺點會阻礙其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展；最后，除通過合理的策略消除上述障礙外，NIR-Ⅱ熒光材料在動物模型中的活性、毒理學(xué)和藥代動力學(xué)評價測試，對于NIR-Ⅱ熒光成像的進一步發(fā)展至關(guān)重要.