丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復蘇對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用

張瓊月，張婧婧，蔣琳琳，吳唐靜，張宗澤，王焱林

武漢大學中南醫(yī)院麻醉科（武漢 430071）

失血性休克是臨床常見的死亡原因之一[1]。失血性休克后，需在短時間內進行復蘇，但復蘇早期的再灌注損傷易導致患者出現(xiàn)多器官損傷[2]，如腎臟對缺血再灌注十分敏感，容易發(fā)生損傷，嚴重時出現(xiàn)腎功能衰竭[3]。研究顯示，靜脈復蘇對失血性休克伴發(fā)的腎臟損傷的治療效果并不理想，同時，大量快速液體復蘇可造成腎臟進一步損傷，因此，減輕因休克復蘇后再灌注產生的腎損傷十分關鍵[4-6]。炎癥損傷是造成器官再灌注損傷的主要原因[7-8]。組織器官發(fā)生再灌注損傷取決于組織器官內炎性反應的程度與性質，與炎癥反應有關的細胞因子主要有腫瘤壞死因子和白細胞介素等[9]。JAK/STAT 通路廣泛參與細胞應激、生長、增殖、分化和凋亡等。TNF-α、IL-1β等多種細胞因子都是通過活化JAK/STAT 通路進行信號轉導[10-11]。研究表明，JAK2/STAT3 信號通路參與了腎缺血再灌注損傷過程[12]。丙酮酸是機體代謝的重要中間產物和三羧酸循環(huán)底物。研究顯示丙酮酸鹽可以減輕失血性休克動物由于復蘇所致的器官缺血再灌注損傷[13]。本團隊前期研究中還發(fā)現(xiàn)，丙酮酸鹽腹腔復蘇能夠抑制失血性休克大鼠腸組織JAK2/STAT3信號通路，改善腸缺血再灌注損傷。據(jù)此，本研究擬探討丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復蘇對腎缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

由湖北省實驗動物研究中心提供健康成年雄性SPF級SD大鼠40只，體重為200～250 g。采用隨機數(shù)字表法隨機分為假手術組（Sham組）、靜脈復蘇組（VR組）、生理鹽水腹腔復蘇組（NR組）和丙酮酸鹽腹腔復蘇組（PR組） 4組，每組10只。本實驗程序經武漢大學動物實驗中心實驗動物管理與使用委員會批準（WP2020-08138）。

1.2 主要試劑

2.5%葡萄糖丙酮酸鹽腹膜透析液（P-PDS）：丙酮酸根離子40 mmol/L、Na+132 mmol/L、Ca2+1.75 mmol/L、Mg2+0.25 mmol/L、Cl-96 mmol/L、葡萄糖濃度為2.5%， 用HCl或NaOH調pH值至5.2。TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔來源一抗p-STAT3（ab30647，英國Abcam公司）、p-JAK2（ab32101，英國Abcam公司），GAPDH一抗（ab37168，英國Abcam公司）、二抗（074-1506，美國KPL公司）。

1.3 模型制備

對大鼠術前禁食12 h、禁水4 h以制備失血性休克模型[14]。1%戊巴比妥鈉（1 g/100mL，雙蒸水配制）40 mg/kg腹腔注射麻醉后，行頸總動脈和股靜脈穿刺置管術（一次性使用靜脈留置針24G*19mm/Y，威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司），分別用于監(jiān)測血壓和給藥。經右股靜脈行全身肝素化（300 U/kg），經左股動脈放血造模：行左股動脈穿刺置管術后經左股動脈放血，于10 min左右使平均動脈壓降至（35±5）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并維持該水平1 h，記錄大鼠失血量。Sham組僅行右頸總動脈、左股動脈、右股靜脈穿刺及全身肝素化；VR組制備模型1 h后經右股靜脈采用微量輸液泵回輸放出的血液及兩倍失血量行靜脈復蘇；NR組模型1 h后行靜脈復蘇的同時采用微量輸液泵向腹腔輸注20 mL生理鹽水行腹腔復蘇，持續(xù)輸注30 min；PR組制備模型1 h后行靜脈復蘇的同時采用微量輸液泵向腹腔輸注20 mL P-PDS，行腹腔復蘇，持續(xù)輸注30 min。

復蘇24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，麻醉后開腹，暴露下腔靜脈，采集血標本，室溫靜置30 min，4℃，2 500×g 離心10 min，取上清備用，隨即放血處死動物，取右側腎臟，冰生理鹽水洗凈后于冠狀面切為兩半，一半腎臟采用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片行HE染色，用普通光學顯微鏡觀察。另一半腎臟放入液氮中凍存1 h后轉移至-80 ℃冰箱保存[15]。

1.4 腎組織HE染色與腎小管損傷評分

經4%多聚甲醛固定后的腎組織使用自動脫水機經過程序脫水后石蠟包埋，使用自動切片機橫切面4 μm連續(xù)切片，放入60 ℃恒溫烤箱內烤片，24 h后進行HE染色。使用200倍光學顯微鏡在室溫下對染色封片的腎組織結構與形態(tài)、腎小球完整性、炎性細胞浸潤情況進行觀察并拍照。根據(jù)腎小管損傷評分指數(shù)（Paller評分）進行評分[16]，隨機選取光鏡下10個視野，每個視野選取10個腎小管，每出現(xiàn)一個改變則按照以下規(guī)則計分：腎小管明顯擴張、細胞扁平計1分；刷狀緣損傷計1分，脫落計2分；間質水腫計1分；細胞空泡變性計1分；腎小管管腔內有脫落壞死的細胞但未形成管型計1分，形成管型計2分；細胞核固縮計1分；上皮細胞顆粒變性計1分。10個視野分值累加為Paller評分，分值越高表明腎小管損傷越嚴重。

1.5 檢測指標

采用血液分析儀（300-G，美國雅培公司）檢測血清血尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）和血清肌酐（creatinine，Cr）的濃度，利用酶聯(lián)免疫吸附法測定腎組織 TNF- α和 IL-1β含量（DR-200Bs酶標儀，中國Diatek公司），腎組織p-STAT3、p-JAK2的表達使用Western blot技術進行檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)和標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩組比較采用事后兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腎組織形態(tài)學變化與腎小管損傷評分

光鏡下（200倍）Sham組腎組織切片可見腎單位基本正常，腎間質細胞未見明顯水腫，未見明顯的炎性細胞浸潤，腎小球內細胞排列正常。VR組腎組織切片可見腎單位大體結構存在，但腎小球細胞萎縮，基底膜斷裂，結構排列混亂，腎間質內可見大量炎性細胞浸潤，大量腎小管壞死細胞團塊，有較多炎性細胞團塊聚集，毛細血管可見淤血及管型存在，近端腎小管可見明顯空泡樣結構，管腔擴張，刷狀緣脫落，遠端小管內可見壞死細胞碎片及其形成的管型，部分腎小管內甚至可見淀粉樣物質團塊。NR組腎組織切片可見腎單位結構基本存在，與VR組相比，其病理損傷程度減輕，腎小球細胞排列正常，基底膜完整，炎性細胞浸潤程度減輕，部分腎小管內有管型，刷狀緣脫落，但腎小管細胞明顯水腫。與VR組、NR組相比，PR組腎病理損傷程度最輕，腎單位結構基本存在，腎間質內僅可見少量炎性細胞浸潤，刷狀緣基本存在，毛細血管少量淤血，未見管型形成，但可見腎小管細胞水腫（圖1）。四組間在Paller評分上存在顯著差異，VR組（55.0±4.8）評分最高，顯著高于NR組（32.0±5.4）、PR組（21.4±3.8）與Sham組（9.2±2.9），而Sham組評分最低（圖2）。

圖1 各組大鼠腎臟組織光鏡下形態(tài)學變化（HE x200）Figure 1. The morphological changes of rat kidney tissue under light microscope in each group (HE x200)

圖2 各組大鼠腎損傷評分比較Figure 2. Comparison of rat kidney injury scores in each group

2.2 檢測指標的變化

與Sham組相比，其他3組的BUN、Cr濃度，TNF-α、IL-1β含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。VR組、NR組和PR組3組間BUN、Cr濃度和TNF-α、IL-1β含量均呈逐漸下降的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。相較于Sham組，腎組織p-JAK2和p-STAT3蛋白在VR組、NR組和PR組中的表達均顯著上調，p-JAK2在PR組表達量低于其他2組，而p-STAT3在VR組、NR組和PR組3組中的表達量呈明顯下調趨勢（表1）。

表1 各組大鼠腎組織檢測指標比較Table 1. Comparison of the detection indexes of rat kidney tissue in each group

3 討論

失血性休克復蘇可導致全身器官發(fā)生缺血再灌注損傷[17]。傳統(tǒng)的觀念是休克后及早進行靜脈液體復蘇，恢復有效血容量以阻止休克造成的器官組織損傷進一步發(fā)展。而接受常規(guī)靜脈液體復蘇的病人卻常常會發(fā)生多器官功能衰竭，甚至死亡，其原因通常是漸進的內臟血管收縮、血流灌注不足、全身炎癥反應及液體不足等[5]。大量資料表明，失血性休克進行靜脈復蘇后患者內臟器官的血流并沒有恢復，全身炎癥反應進一步加重，細胞損傷進一步惡化，導致患者多器官功能障礙死亡[18]。雖然傳統(tǒng)的復蘇方法能夠改善包括血壓在內的傳統(tǒng)指標，但是對胃腸道及肝腎脾等內臟器官灌注狀態(tài)的效果有限。

本研究中，PR組Paller評分顯著低于VR組和NR組，提示腎小管損傷較小。此外，PR組大鼠血液BUN與Cr的含量也低于其他復蘇方式。在腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷時，TNF-α、IL-1β等炎癥因子起到重要作用[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)抑制TNF-α和IL-1β的水平，可以改善腎缺血再灌注損傷[21-22]。本研究也同樣觀察到腎缺血再灌注損傷時，TNF-α和IL-1β的水平顯著升高，與其他復蘇方式相比，采用丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復蘇顯著降低了TNF-α和IL-1β的水平。以上結果表明，丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復蘇改善腎缺血再灌注損傷，其可能與抑制炎癥反應有關。

JAK/STAT通路主要由 JAKs蛋白家族和 STATs蛋白家族組成，JAK是 STAT上游靶點，接受細胞外的細胞因子信號刺激并通過調控基因轉錄，進而通過JAK/STAT通路廣泛參與細胞應激、生長、增殖、分化和凋亡等。沈誠等研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT通路在臟器缺血再灌注損傷中起到關鍵作用[23]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在腎缺血再灌注損傷中，JAK2/STAT3信號通路明顯上調，其介導的炎癥反應加重了腎損傷[24]。Lu等發(fā)現(xiàn)敲除STAT3基因后，JAK2/STAT3通路受到抑制，腎組織的炎癥及損傷明顯減輕[25]。鄧江濤等發(fā)現(xiàn)丙酮酸鹽腹腔復蘇能夠降低腸損傷過程中JAK2/STAT3的磷酸化水平，抑制JAK/STAT通路的激活[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注大鼠的JAK2/STAT3通路明顯激活，進一步證實JAK2/STAT3信號通路在上述病理進程中發(fā)揮重要作用。采用生理鹽水腹腔復蘇可下調p-STAT3的表達，而p-JAK2的表達水平與單純靜脈復蘇無明顯差異，但丙酮酸鹽腹腔復蘇可明顯下調JAK2/STAT3蛋白磷酸化水平，提示采用丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復蘇能夠更顯著地抑制JAK2/STAT3信號通路。JAK2/STAT3信號通路能夠介導炎癥反應，也能因炎癥反應而被進一步激活，本研究后續(xù)將進一步研究丙酮酸鹽腹膜透析液腹腔復蘇與JAK2/STAT3信號通路及炎癥反應三者之間更為具體的調控關系。

本研究顯示，丙酮酸鹽腹膜透析液可減輕腎臟的缺血再灌注損傷，降低炎性反應，抑制p-JAK2/STAT3蛋白表達，改善腎功能。其機制可能與降低炎癥反應、抑制JAK2/STAT3信號通路的激活有關。