基于水楊酸和硫脲碳納米點的制備及其抗炎作用研究

鄭夢丹， 劉莉莉， 李嫻靜， 徐曉薇， 孫宏晨

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科， 2.牙周科，吉林 長春 130021）

炎癥在疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]，新型冠狀病毒的炎癥風(fēng)暴未得到及時有效的控制會立刻導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多器官功能衰竭[2]，甚至導(dǎo)致患者死亡。 炎癥較嚴(yán)重時，由于病原微生物及其毒素的作用， 以及局部血液循環(huán)障礙、 發(fā)熱等因素的影響，心、肝、腎等器官的實質(zhì)細(xì)胞可發(fā)生不同程度的變性、壞死和器官功能障礙[3]。 因此，抑制過度炎癥反應(yīng)在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面具有意義[4]。 用來抑制炎癥的藥物主要有抗生素、類固醇類激素、非甾體類抗炎藥等[5]。 但臨床應(yīng)用抗生素易產(chǎn)生耐藥性；固醇類激素用于系統(tǒng)性治療容易導(dǎo)致皮膚、胃腸道副作用等； 非甾體抗炎藥如阿司匹林存在溶解性不佳、導(dǎo)致消化和神經(jīng)系統(tǒng)副反應(yīng)等應(yīng)用缺陷；而生物制品類如抑肽酶、抗氧化劑等成本高昂，不利于臨床廣泛使用。 納米材料由于具有獨特的尺寸效應(yīng)，在人類生活中發(fā)揮著重要的作用。 納米材料已逐漸被應(yīng)用于各種領(lǐng)域，例如光電器件、機(jī)械、計算機(jī)、醫(yī)學(xué)診斷等[6]。 碳納米點（CDots）是指尺寸小于10 nm 的由碳元素作為主要成分的納米材料，其不僅有穩(wěn)定的熒光特性，良好的生物相容性，還能夠進(jìn)行多功能修飾，從而在腫瘤治療中抵抗多藥耐藥、靶向腫瘤微環(huán)境[7]。 此外，還可通過載藥和光熱治療、光聲治療等各種策略相結(jié)合發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。 本研究以水楊酸和硫脲為原料通過化學(xué)反應(yīng)合成小分子藥物碳納米點，探討其對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥模型的抗炎作用，結(jié)合材料表征分析其可能機(jī)制，從而為控制炎癥提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

水楊酸（≥99.5%）、硫脲（99%）（上海麥克林生化科技有限公司，中國），用于封裝的環(huán)氧硅樹脂A和B（98%）（奧斯邦有限公司，中國）。 高糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco 公司，中國），胎牛血清（Biological Industries 公司，美國）和青霉素/鏈霉素溶液（Hyclone公司， 美國）。 磷酸緩沖鹽溶液 （phosphate buffer saline，PBS）粉（Amresco 公 司，美 國），Annexin Ⅴ-FITC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（天津三箭技術(shù)股份有限公司，中國），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司， 中國）。 小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）抗體、小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）抗體、小鼠GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-羊抗小鼠二抗 （Proteintech 公司，美國），胎牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、蛋白上樣緩沖液（5×）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝脈電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) （10 000~180 000）（Thermo Fisher Scientific公司， 美國）， 聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（Bio-Rad 公司，美國），聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF]膜（Millipore 公司，美國），電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯影液（Proteintech 公司，美國）。TRIeasyTM總RNA 提取試劑盒 （上海翊圣科技有限公 司， 中 國），PrimerScripteTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒和SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa 公司，中國），引物（上海Sangon Biotech 公司，中國）。滲析袋（截留分子量=1 000 D）（Spectrum Laboratories 公司，美國）。 三氯甲烷、異丙醇、乙醇等普通商用化學(xué)試劑均為分析純。 所有實驗用水通過蒸餾提純2 次。

1.2 水楊酸/硫脲碳納米點的合成

將1.53 g 的水楊酸和2.4 g 的硫脲添加到20 mL去離子水中，然后將混合物在家用500 W 的微波爐中加熱4 min。 在該加熱過程中，整體體系從原來的無色液體變成棕色液體，并最終形成亮黃色的簇狀固體。 接下來，為了去除未反應(yīng)的小分子，將制備好的碳納米點用截留分子量為1 000 D 的滲析膜在去離子水中滲析1 d， 進(jìn)而完全去除未反應(yīng)的小分子原料（如水楊酸等）。 最后，使用含有少量無水乙醇的DMEM 培養(yǎng)液溶解碳納米點，并將碳納米點配成不同濃度的溶液，以備后續(xù)實驗使用。

1.3 碳納米點的表征

使用H-800 透射電子顯微鏡 （TEM，Hitachi 公司，日本）對合成碳納米點的形態(tài)進(jìn)行表征。 使用AVATAR 360 傅里葉變換紅外光譜 （FTIR） 儀器（Nicolet 公司，美國）分別測試得到水楊酸、硫脲和碳納米點的FTIR 光譜。通過ESCALAB MKII 型能譜儀（VG 公司，美國）得到碳納米點的X 射線光電子能譜。

1.4 碳納米點的體外毒性試驗

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7（上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，中國）培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)液中，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

通過CCK-8 試劑盒測定法測試碳納米點的細(xì)胞毒性。 將細(xì)胞接種于96 孔板中進(jìn)行細(xì)胞增殖能力測定。 將RAW264.7 細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種，并將其培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。 然后棄去原培養(yǎng)液， 將DMEM 培養(yǎng)液稀釋碳納米點至0、10、20、50、100 和200 μg/mL， 隨后分別將其添加到每個孔中。孵育24 h 后，向每孔中添加10 μL CCK-8 溶液，37 ℃下溫育2 h 后，使用酶標(biāo)儀（型號：RT-6000；深圳雷都生命科技有限公司，中國）在450 nm 波長光激發(fā)下測量吸光度值。 細(xì)胞存活率（%）=不同濃度碳納米點組吸光度值/空白對照組吸光度值×100%

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 的水平

將RAW264.7 細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后設(shè)置分組：①空白對照組；②LPS 對照組（100 ng/mL）；③碳納米點組（100 ng/mL LPS，200 μg/mL 碳納米點）。分別孵育24 h 和48 h，收集細(xì)胞，并通過TRIeasyTM總RNA 提取試劑盒提取總RNA。 使用PrimerScripteTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒， 將1 μg 總RNA 樣品用于每個逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用SYBR Premix Ex Taq 試劑通過MxPro Mx3005P 實時PCR 檢測系統(tǒng)進(jìn)行RTqPCR 以測定TNF-α、IL-1β 和ACTB 的水平 （其中ACTB 用作內(nèi)部對照）。實驗中具體所用引物序列見表1，具體操作按試劑說明書進(jìn)行。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.6 Western bloting 法檢測炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β 的表達(dá)

將RAW264.7 細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后去除培養(yǎng)液。 實驗分為：①空白對照組；②LPS 對照組（100 ng/mL）；③碳納米點組（100 ng/mL LPS，200 μg/mL 碳納米點）。 分別孵育24 h 和48 h 后， 使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液裂解細(xì)胞以獲得細(xì)胞蛋白質(zhì)。取30 μg 蛋白質(zhì)提取物在SDS-PAGE 上電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。 在室溫下用5% BSA 封閉1 h，然后將其與一抗在4 ℃孵育過夜。 使用以下一抗： 抗GAPDH [10494-1-AP，1∶10 000（Proteintech）]，抗TNF-α[17590-1-AP，1∶1 000（Proteintech）]和抗IL-1β[bs-0812R，1∶2 000（Bioss）]。 然后，加入二抗[17780-1-AP，1∶10 000（Proteintech）]，并在室溫下孵育1 h。 根據(jù)傳統(tǒng)的實驗操作流程，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑檢測信號，進(jìn)行顯色觀察，并通過Image J 軟件分析條帶灰度值對結(jié)果進(jìn)行定量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 各組細(xì)胞中TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)水平均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間樣本均數(shù)采用兩獨立樣本t 檢驗進(jìn)行比較。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TEM 結(jié)果

TEM 結(jié)果顯示，鏡下碳納米點具有良好的分散性，沒有發(fā)生聚集。 在高分辨率透射電鏡圖像中可以清楚觀察到碳納米點的晶格條紋分布均勻，清晰可辨，晶格間距約0.21 nm。 通過測量透射電鏡圖中納米粒子直徑進(jìn)行統(tǒng)計， 碳納米點直徑為3.0~4.2 nm，平均3.5 nm。 詳見圖1。

圖1 碳納米點的表征Figure 1 Characterizations of the CDots

2.2 FTIR 和X 射線光電子能譜結(jié)果

水楊酸的FTIR（圖2A）顯示，羧酸C=O 伸縮振動位于1 670 cm-1， 羧基C-O 伸縮振動位于1 292 cm-1，羧基O-H 彎曲振動位于1 325 cm-1。 以上所有的振動峰都屬于羧基基團(tuán)[9]。 此外，酚羥基在1 246 cm-1處具有C-O 伸縮振動，在1 325 cm-1處具有彎曲振動。羧基和酚羥基O-H 的伸縮振動范圍從2 900 cm-1開始，至3 500 cm-1結(jié)束。 硫脲的FTIR（圖2B）顯示，在3 100~3 500 cm-1處，N-H 發(fā)生伸縮振動[10]，在1 610 cm-1處發(fā)生N-H 彎曲振動，在1 080 cm-1處發(fā)生C-N 伸縮振動， 在1 410 和1 475 cm-1處有NH=S 伸縮振動。 碳納米點的FTIR（圖2C）顯示，碳納米點的O-H/N-H 伸縮振動在3 000~3 500 cm-1， 碳納米點的C＝O 伸縮振動位于1 620 cm-1，N-H 彎曲振動位于1 540 cm-1。此外，碳納米點在2 050 cm-1處還出現(xiàn)了一個新的吸收峰。

圖2 水楊酸、硫脲及合成碳納米點的FTIR 分析Figure 2 FTIR spectra of salicylic acid, thiourea, and CDots

碳納米點的X 射線光電子能譜顯示，其由碳元素（C）、氮元素（N）、氧元素（O）和硫元素（S）組成（圖3）， 且元素的原子數(shù)比例為C∶N∶O∶S=54.4∶35.7∶2.0∶7.9。

圖3 碳納米點的X 射線光電子能譜Figure 3 X-ray photoelectron spectrum of the fabricated CDots

2.3 碳納米點的生物安全性

CCK-8 實驗結(jié)果顯示， 隨著碳納米點濃度從0增加至200 μg/mL， 各組細(xì)胞活性仍維持在80%~90%。 實驗中，經(jīng)CCK-8 溶液處理后，細(xì)胞在短時間內(nèi)顏色明顯變化， 不同濃度的碳納米點處理后，細(xì)胞增殖與對照組相比沒有明顯下降。 如圖4 所示，各濃度（10、20、50、100 和200 μg/mL） 碳納米點均沒有明顯的細(xì)胞毒性（P>0.05）。此外，實驗中鏡下沒有觀察到明顯的細(xì)胞形態(tài)改變。

圖4 不同濃度碳納米點對RAW264.7 細(xì)胞活性的影響Figure 4 The effect of different concentrations of CDots on viabilities of RAW264.7 cells

2.4 RT-qPCR 結(jié)果

與碳納米點共培養(yǎng)24 h 后，LPS 組的TNF-α 水平比空白對照組高23.3 倍，LPS 處理組的IL-1β 水平比空白對照組組升高315 倍；碳納米點組TNF-α和IL-1β 的表達(dá)比LPS 組分別降低了44.8%和89.7%（P<0.01）， 見圖5A、B。 處理48 h 后，LPS 組TNF-α 的表達(dá)比空白對照組高8.3 倍，IL-1β 的表達(dá)比空白對照組高353.8 倍；碳納米點組TNF-α 的表達(dá)比LPS 組低26.6%（P<0.05），IL-1β 的表達(dá)比LPS 組低78.6%（P<0.01），見圖5C、D。

圖5 RT-qPCR 法檢測碳納米點的體外抗炎效果Figure 5 In vitro anti-inflammation effect of CDots evaluated by RT-qPCR

2.5 Western blotting 結(jié)果

處理24 h 后，LPS 組細(xì)胞相對于空白對照組，TNF-α 和IL-1β 表達(dá)顯著增加，條帶明顯增寬（圖6A）。碳納米點組細(xì)胞TNF-α 和IL-1β 表達(dá)顯著降低（P<0.05），見圖6B。 處理48 h 后，與空白對照組比，TNF-α 表達(dá)稍上升，IL-1β 表達(dá)顯著增加，條帶明顯增寬（圖6C）。 碳納米點組相對于LPS 組，TNF-α 的表達(dá)顯著降低（P<0.01），IL-1β 的表達(dá)降低（P<0.05）。詳見圖6D。

圖6 Western blotting 法檢測碳納米點處理后，各組細(xì)胞中TNF-α 和IL-1β 的蛋白表達(dá)量Figure 6 Western blotting assay of inflammation-related protein TNF-α and IL-1β after treatment with CDots

3 討論

碳納米點具有良好的生物相容性，同時還具有合成便利，反應(yīng)原料價格低廉、易于批量生產(chǎn)的優(yōu)點，因此，可以安全地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[11]。 本文中所制備的碳納米點在TEM 下其晶格間距約0.21 nm，與先前研究中報道的石墨結(jié)構(gòu)中晶面之間的距離（100）一致[12]。清楚的晶格條紋證明了我們所制備的碳納米點是經(jīng)過了反應(yīng)原料水楊酸和硫脲之間的縮聚和碳化反應(yīng)而生成的，而不只是單純的小分子之間的物理吸附。 碳納米點的平均直徑為3.5 nm，具有良好的分散性，該特點不僅有利于碳納米點進(jìn)入細(xì)胞， 也有利于碳納米點在體內(nèi)的形成是均勻分布的[13]，從而能更高效率地發(fā)揮抗炎作用。

FTIR 分析揭示了碳納米點的化學(xué)結(jié)構(gòu)和形成機(jī)制。 水楊酸的FTIR 證明其具有羧基和酚羥基，而硫脲的FTIR 顯示，在3 100~3 500 cm-1處發(fā)生N-H 伸縮振動， 在1 610 cm-1處發(fā)生N-H 彎曲振動，在1 080 cm-1處發(fā)生C-N 伸縮振動，在1 410和1 475 cm-1處有N-H=S 伸縮振動， 顯示存在胺基。 水楊酸的羧基/羥基和硫脲的胺基確保隨后的脫水縮合和碳化反應(yīng)以形成碳納米點。 碳納米點的FTIR 顯 示，O-H/N-H 在3 000~3 500 cm-1處有伸縮振動，說明碳納米點中存在羥基和胺基。 與水楊酸的C＝O 伸縮振動相比， 碳納米點的C＝O 伸縮振動移至1 620 cm-1，后者與酰胺I 帶的位置一致。與硫脲相比，碳納米點的N-H 彎曲振動也從1 610 cm-1移至1 540 cm-1，后者與酰胺Ⅱ帶的位置一致[14]。此外， 合成的碳納米點在2 050 cm-1處出現(xiàn)了一個新的吸收峰，可能是由于仲胺的N-H 伸縮振動所產(chǎn)生的[15]。這些結(jié)果說明，碳納米點的形成是基于羧基/羥基和胺基之間的脫水縮合及進(jìn)一步碳化[16]。 進(jìn)一步的研究顯示，X 射線光電子能譜證明碳納米點由碳元素、氮元素、氧元素和硫元素組成，其中碳元素來自于水楊酸和硫脲， 氧元素來自于水楊酸，氮元素和硫元素來自于硫脲。元素的原子數(shù)比例為C∶N∶O∶S=54.4∶35.7∶2.0∶7.9， 可以看出碳元素為主要成分，因而稱其為碳納米點。 已有研究顯示，合成小分子碳納米點的原料官能團(tuán)之間可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使得藥品具有抗炎作用[17-18]。 因此，我們認(rèn)為本文中合成的碳納米點通過水楊酸的羧基與硫脲的胺基之間發(fā)生反應(yīng)，生成了具有抗炎作用的酰胺鍵[17，19]，同時仍保持了具有抗炎活性的表面官能團(tuán)[18]，使得合成碳納米點具有更加良好的生物抗炎應(yīng)用潛能。并且，由于碳納米點的純化過程中已經(jīng)完全去除未反應(yīng)的小分子原料（水楊酸和硫脲），所以發(fā)揮抗炎作用的是碳納米點本身。 除此以外，紅外官能團(tuán)的檢測也顯示，合成的碳納米點具有羧基基團(tuán)，因而具有強(qiáng)吸水性， 碳納米點之間表面大量的羧基、羥基及氨基基團(tuán)能夠電離，使碳納米點具有非常好的親水性，并在水溶液中能維持單分散狀態(tài)，更加有利于其在細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)的均勻分布。

生物安全性對于碳納米點的應(yīng)用起著至關(guān)重要的作用。 本研究中，我們通過CCK-8 實驗觀察碳納米點的細(xì)胞毒性，不同濃度的碳納米點與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 后均未表現(xiàn)出明顯的毒性作用， 同時，在鏡下沒有觀察到明顯的細(xì)胞形態(tài)改變，證實了合成的碳納米點具有較好的生物相容性，為進(jìn)一步的體外和體內(nèi)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

為了研究碳納米點的抗炎作用， 我們使用LPS誘導(dǎo)了RAW264.7 細(xì)胞的炎癥狀態(tài)，并通過檢測碳納米點處理后細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的表達(dá)，來評估碳納米點對炎癥的抑制作用。LPS 是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，可在動物中引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。 TNF-α 由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并在免疫反應(yīng)的急性期增加。IL-1β 也由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。先前的研究顯示，LPS 作用于巨噬細(xì)胞以釋放TNF-α，而TNF-α 能和LPS 共同進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞釋放IL-1β， 導(dǎo)致IL-1β 的分泌量明顯高于TNF-α。 我們利用LPS 處理細(xì)胞24 h 和48 h 后，通過RT-qPCR 實驗檢測到IL-1β 和TNF-α顯著增加， 通過Western blotting 實驗檢測到IL-1β和TNF-α 對應(yīng)條帶明顯增寬，均說明LPS 成功誘導(dǎo)了細(xì)胞的炎癥狀態(tài)。 利用200 μg/mL 碳納米點和LPS 共同處理細(xì)胞后，RT-qPCR 實驗檢測到相對于單獨LPS 處理的細(xì)胞，其TNF-α 和IL-1β 顯著降低（P<0.05）。Western blotting 實驗進(jìn)一步檢測到TNF-α和IL-1β 蛋白表達(dá)降低， 表明碳納米點在蛋白水平抑制了炎癥因子的表達(dá)。 研究表明，水楊酸能夠通過抑制環(huán)氧合酶活性，減少前列腺素生成進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用[20]，合成的碳納米點保留了水楊酸的主要官能團(tuán)，因此，具有抗炎活性。 此外，某些含有酰胺基團(tuán)的物質(zhì)，例如β-內(nèi)酰胺，可以達(dá)到強(qiáng)抗炎作用，紅外測試結(jié)果證明合成的碳納米點生成了酰胺鍵。 因此，我們推測合成的碳納米點能夠穩(wěn)定高效地發(fā)揮抗炎作用，分子中合成的酰胺鍵發(fā)揮了有效的協(xié)同作用，增強(qiáng)了抗炎效果[18]。

綜上所述，我們通過微波輔助加熱水楊酸和硫脲制備了一種具有抗炎作用的碳納米點，所得的碳納米點具有納米級尺寸、優(yōu)異的生物相容性、良好的水溶性， 并通過RT-qPCR 和Western blotting 實驗證明了藥物碳納米點對炎癥因子有抑制作用，證明其能夠很好地應(yīng)用于抗炎， 為后續(xù)開發(fā)更多種類、更強(qiáng)藥效的抗炎藥物體系提供了更多的研究思路，具有良好的應(yīng)用前景。 同時，碳納米點表面所具有的羧基和氨基等化學(xué)基團(tuán)，也有利于對其進(jìn)行表面修飾，從而有望實現(xiàn)更多的生理功能。