實時熒光定量PCR法分析結(jié)核分枝桿菌耐藥性的價值觀察

張 三 唐姍姍

1.新鄭市人民醫(yī)院科檢驗科 (河南 新鄭 451100)

2.新鄭市城關鄉(xiāng)衛(wèi)生院檢驗科 (河南 新鄭 451100)

結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染可引發(fā)結(jié)核病，對患者生命安全構(gòu)成嚴重威脅。近年來，結(jié)核病發(fā)病率逐年上升，小部分結(jié)核病患者病情進展為利福平耐藥結(jié)核，而大部分患者發(fā)展為多重耐藥結(jié)核，給治療增加難度[1]?，F(xiàn)階段，臨床對于MTB的檢測主要依靠藥物敏感度試驗及結(jié)核菌培養(yǎng)等，雖該方法準確性好且操作成本較低，但培養(yǎng)周期較長，在此期間內(nèi)易延誤患者最佳治療時機[2]。隨著醫(yī)療技術的快速發(fā)展，實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)法在臨床上的應用具有檢測速度快、檢查成本低等特點，可為臨床診斷MTB耐藥提供可靠依據(jù)[3]。鑒于此，本研究采用實施熒光定量PCR法分析MTB耐藥性，旨在探究其臨床應用價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年10月至2020年11月我院收治的結(jié)核病患者84例，均符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]中疾病相關診斷標準，本研究獲倫理委員會批準。其中男45例，女39例；年齡19～69歲，平均年齡(44.58±3.61)歲。

1.2 方法(1)核酸提?。簩?0L核酸提取液加入核酸提取試管中，刮取少量菌落轉(zhuǎn)移至試管中，在核酸快速提取儀下振蕩10min，并將其置于95℃金屬浴內(nèi)10min，隨后取出并離心處理1min獲得核酸，用于擴增操作。(2)檢測準備及原理：對利福平、鏈霉素、異煙肼、阿米卡星、乙胺丁醇、莫西沙星等藥物的耐藥狀況進行分析。按照待檢測樣本數(shù)量的5倍，準備200L平蓋PCR薄壁管，分別從試劑盒中提取擴增反應液A/B/C/D/E，徹底融化后漩渦震蕩。按照每管25L分裝各擴增反應液至PCR薄壁管中，隨后將其轉(zhuǎn)移至PCR模板加樣區(qū)。向每個樣品中加入同一模板DNA 5L，保證每管總體積為30L。(3)PCR擴增及結(jié)果的判斷：將PCR反應管置于熒光PCR儀中，行擴增操作，檢測結(jié)果由MTB耐藥基因檢測分析系統(tǒng)進行輔助的判讀。

1.3 觀察指標以羅氏藥敏比例法作為檢測MTB耐藥性的“金標準”，分析FQ-PCR法在MTB耐藥性中的應用價值，包括靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值。以n表示總例數(shù)，a表示真陽性，b表示假陽性，c表示假陰性，d表示真陰性。靈敏度=a/(a+c)，特異度=d/(b+d)，準確度=(a+d)/n，陽性預測值=a/(a+b)，陰性預測值=d/(c+d)。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，F(xiàn)Q-PCR法診斷MTB耐藥性與羅氏藥敏比例法檢查結(jié)果的一致性使用kappa檢驗，kappa值≥0.75表示一致性良好，0.4～0.74表示一致性尚可，＜0.4表示一致性不佳；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

FQ-PCR法分析MTB耐藥性中各藥物靈敏度、特異度、陽性預測值比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而準確度及陰性預測值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。kappa檢驗顯示：對阿米卡星檢測一致性不佳(kappa值為0.279)；對利福平、異煙肼、莫西沙星及乙胺丁醇一致性尚可(kappa值分別為0.637、0.631、0.578、0.623)；對鏈霉素一致性良好(kappa值為0.815)。

表1 FQ-PCR法在MTB耐藥性分析中的應用價值

3 討 論

現(xiàn)階段，臨床對于結(jié)核病的治療主要采用藥物的方式，通常采用一線及二線抗癆藥物聯(lián)合使用，其中一線抗癆藥物包括利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、異煙肼，可取得一定的效果，安全性高[5-6]。而二線抗癆藥物包括氟喹諾酮類、阿米卡星、卡那霉素類藥物，但單純用藥存在較高的風險，加之不規(guī)則的錯誤的化療，使得藥物耐藥性大大上升，患者治療依從性明顯下降[7-8]。故對上述抗結(jié)核藥物耐藥性行積極的管理有助于更好的給出治療方案指導臨床治療。

既往傳統(tǒng)培養(yǎng)法在藥敏結(jié)果檢測中耗時較長，易延誤患者治療時機。近年來，分子診斷技術在MTB耐藥檢測中得到廣泛應用，MTB耐藥的產(chǎn)生是因自身基因突變而導致[9]。因此，對某些基因片段發(fā)生突變在耐藥菌株中占較大比例時，可通過對基因片段進行檢測判斷該菌株的耐藥情況。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-PCR法分析MTB耐藥性中各藥物靈敏度、特異度、陽性預測值比較差異有統(tǒng)計學意義，而準確度及陰性預測值比較差異無統(tǒng)計學意義。kappa檢驗顯示：對阿米卡星檢測一致性不佳(kappa值為0.279)；對利福平、異煙肼、莫西沙星及乙胺丁醇一致性尚可(kappa值分別為0.637、0.631、0.578、0.623)；對鏈霉素一致性良好(kappa值為0.815)，提示FQ-PCR法在MTB耐藥性診斷中應用價值較高，能夠檢出MTB對藥物的耐藥性，且一致性較強。究其原因可知FQ-PCR法具有檢測時間短、成本低、藥物檢測種類多等優(yōu)勢，能夠有效避免PCR污染等導致檢測結(jié)果差異等問題。本研究中FQ-PCR法對阿米卡星耐藥性檢出一致性不佳，較好說明該基因型檢測位點的耐藥監(jiān)測準確性不高，或存在其他的耐藥基因位點的突變。另該方法對其他藥物耐藥性檢測雖靈敏度不高，或存在耐藥表型與基因型存在差異，可能與MTB表型耐藥不穩(wěn)定而發(fā)生改變相關，亦或與部分突變?yōu)闊o意義突變等不會對MTB耐藥性造成影響[10]。

綜上所述，實施熒光定量PCR法在MTB耐藥性檢測中應用價值較高，具有較好的應用前景，可為臨床用藥提供指導，值得推廣。