豬場(chǎng)口蹄疫O 型病毒抗體檢測(cè)與分析

谷冉坤，張秀衛(wèi)，賈亞淼，甄江

（1.趙縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 趙縣 051530； 2.石家莊市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北 石家莊 050000）

我國(guó)將口蹄疫病列入一類動(dòng)物疫病首位，對(duì)所有養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)行強(qiáng)制免疫口蹄疫疫苗的政策，要求免疫群體免疫密度常年保持90%以上，免疫抗體合格率常年保持在80%以上。 為切實(shí)了解豬場(chǎng)口蹄疫抗體水平，科學(xué)評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗免疫效果，我疫控中心在3 個(gè)豬場(chǎng)采集血清，用豬口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法檢測(cè)口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體，對(duì)免疫結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為今后我縣豬口蹄疫的防治研究提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)豬場(chǎng)

隨機(jī)選擇3 個(gè)豬場(chǎng)做實(shí)驗(yàn)， 分別用A、B、C場(chǎng)表示，3 個(gè)豬場(chǎng)均為自繁自養(yǎng)， 全進(jìn)全出的飼養(yǎng)方式。 A 場(chǎng)存欄800 頭、B 場(chǎng)存欄1500 頭，C場(chǎng)存欄1200 頭。

1.2 疫苗接種情況

3 個(gè)豬場(chǎng)使用的疫苗均為申聯(lián)生物 （上海）股份有限公司生產(chǎn)的豬口蹄疫O 型合成肽疫苗（多肽2600+2700+2800）， 一瓶50 毫升， 批號(hào)20210104，按照疫苗說(shuō)明書要求，三個(gè)豬場(chǎng)獸醫(yī)均在2021 年4 月份對(duì)豬場(chǎng)40 日齡以上的健康豬肌肉注射1 毫升該疫苗，間隔1 個(gè)月后再次注射1 毫升，病豬、瘦弱、懷孕后期及斷奶前的仔豬沒有接種，接種后豬只未出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。

1.3 檢測(cè)方法

用豬口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法檢測(cè)口蹄疫O 型病毒抗體，檢測(cè)試劑盒為鄭州中道生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，檢測(cè)時(shí)間為2021 年10 月份。

2 樣品前處理

隨機(jī)采集3 個(gè)豬場(chǎng)免疫豬的全血， 采集A場(chǎng)血樣30 份，B 場(chǎng)30 份、C 場(chǎng)30 份，共90 份血樣，用高速離心機(jī)分離出血清，血清清亮無(wú)溶血，對(duì)血清樣品進(jìn)行編號(hào)，A 場(chǎng)樣品編號(hào)1-30 號(hào)，B場(chǎng)樣品編號(hào)31-60 號(hào)，C 場(chǎng)樣品編號(hào)61-90 號(hào)。

3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及試劑

3.1 儀器設(shè)備：100 毫升量筒、500 毫升燒杯，離心管架、電熱恒溫培養(yǎng)箱、微型振蕩器、酶標(biāo)分析儀、洗板機(jī)、1.5 毫升離心管、純化水、0.5～10 微升、10～100 微升和100～1000 微升單道移液器、30～300 微升的多道移液器、不同型號(hào)的吸頭、玻璃棒、移液槽等。

3.2 實(shí)驗(yàn)試劑為鄭州中道生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的豬口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒，批號(hào)：20210701，用于檢測(cè)豬血清中的口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體，適用于評(píng)估豬口蹄疫合成肽疫苗免疫狀況，2℃～8℃保存。

3.3 試劑盒組成

3.3.1 抗原包被反應(yīng)板96T×2 包

3.3.2 陰性對(duì)照血清1.5 毫升×1 瓶

3.3.3 陽(yáng)性對(duì)照血清1.5 毫升×1 瓶

3.3.4 樣品稀釋液50 毫升×1 瓶

3.3.5 酶標(biāo)記結(jié)合物21 毫升×1 瓶

3.3.6 顯色劑A 11 毫升×1 瓶

3.3.7 顯色劑B 11 毫升×1 瓶

3.3.8 終止液11 毫升×1 瓶

3.3.9 濃縮洗滌液（20×）50 毫升×1 瓶

3.3.10 說(shuō)明書1 份

3.3.11 自封袋2 個(gè)

3.3.12 封板膜6 張

3.3.13 96T 稀釋板2 個(gè)

4 檢驗(yàn)原理

微孔板上包被的人工合成的豬口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白多肽， 可與待測(cè)樣品中的特異性抗體（抗-FMDV-VPI）反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物被吸附到固相上， 再加入酶標(biāo)記的抗豬IgG，則形成“固相豬口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗原-豬口蹄疫O 型病毒VPI 抗體-抗豬抗體-HRP”免疫復(fù)合物，洗滌后，如待測(cè)樣品中含有豬口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體， 加入顯色劑即顯色，為陽(yáng)性，反之為陰性。

5 檢驗(yàn)方法

5.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備： 提前2 小時(shí)從冰箱取出所用試劑恢復(fù)至室溫，放置1 小時(shí)以上，使用前充分搖勻，實(shí)驗(yàn)完畢后放回2℃～8℃保存。

5.2 配洗滌液：將濃縮洗滌液（20×）用純化水進(jìn)行20 倍稀釋，用量筒準(zhǔn)確量取10 毫升濃縮洗液加入到盛有190 毫升純化水的燒杯中，用玻璃棒輕輕攪拌均勻后備用。

5.3 編號(hào)：在包被板上設(shè)陰性對(duì)照2 孔，陽(yáng)性對(duì)照2 孔，其余為待檢樣品孔。

5.4 待檢樣品預(yù)稀釋：按照編號(hào)在稀釋板的各待檢樣品孔中將待檢樣品進(jìn)行1∶32 稀釋，取5微升待檢血清樣品加入到155 微升樣品稀釋液中，稀釋每個(gè)樣品時(shí)必須使用不同的吸頭。 陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照不進(jìn)行預(yù)稀釋。

5.5 加樣和溫育： 取出抗原包被反應(yīng)板，分別從稀釋板上取稀釋后的待檢血清100 微升，陰性對(duì)照孔加入陰性對(duì)照血清100 微升，陽(yáng)性對(duì)照孔加入陽(yáng)性對(duì)照血清100 微升。 貼上封板膜，放37℃恒溫箱中溫育30 分鐘。

5.6 洗板機(jī)洗板： 按洗板機(jī)操作說(shuō)明洗板5次。

5.7 加酶標(biāo)結(jié)合物: 在抗原包被反應(yīng)板各孔中加入酶標(biāo)結(jié)合物100 微升。 貼上封板膜，放37℃恒溫箱中溫育30 分鐘。

5.8 洗板機(jī)洗板： 按洗板機(jī)操作說(shuō)明洗板5次。

5.9 加顯色劑：每孔加入顯色劑A 50 微升，全部加完后再在每孔加入顯色劑B 50 微升，混勻。 放37℃恒溫箱中顯色10 分鐘。

5.10 終止：顯色完畢后立即于每孔加50 微升終止液，混勻。

5.11 測(cè)定： 用酶標(biāo)儀在450 納米波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

6.1 試驗(yàn)成立條件： 陰性對(duì)照平均OD 值應(yīng)≤0.2，每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔OD 值應(yīng)≥0.5，否則試驗(yàn)無(wú)效。

6.2 試劑盒臨界值（Cut Off 值）= 0.23×陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD 值，若陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD 值≤2.0， 則按實(shí)際值計(jì)算， 若陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD值＞2.0，則按2.0 計(jì)算。

6.3 若待檢樣品孔OD 值＜Cut Off 值， 判為陰性， 即為抗口蹄疫病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。若待檢樣品孔OD 值≥Cut Off 值，判為陽(yáng)性，即為抗口蹄疫病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽(yáng)性。

7 檢測(cè)結(jié)果與分析

90 份樣品均按上訴步驟進(jìn)行檢測(cè)， 陰性對(duì)照平均OD 值為0.182＜0.2，2 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔OD值分別為0.689、0.692,均＞0.5，此次試驗(yàn)成立。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)， 分析待檢樣品孔OD 值，判斷得出以下結(jié)果：

檢測(cè)結(jié)果顯示：3 個(gè)豬場(chǎng)的血清樣品口蹄疫0 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體合格率分別86.66%、93.33%、83.33%， 均超過(guò)了國(guó)家規(guī)定的抗體合格率在80%以上的標(biāo)準(zhǔn)，免疫效果很好。

樣品口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體結(jié)果匯總表

8 結(jié)論

8.1 通過(guò)檢測(cè)3 個(gè)豬場(chǎng)的口蹄疫O 型病毒VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體， 個(gè)體抗體合格率都比較高，均超過(guò)了國(guó)家規(guī)定的大于80%的標(biāo)準(zhǔn)， 群體免疫合格率100%，整體免疫效果很好。 免疫1 次，間隔1 個(gè)月再免疫1 次豬口蹄疫O 型合成肽疫苗，豬機(jī)體即可產(chǎn)生較高的抗體水平，抗體持續(xù)時(shí)間達(dá)到6 個(gè)月以上，說(shuō)明豬免疫接種口蹄疫合成肽疫苗是預(yù)防豬口蹄疫發(fā)生的最有效手段。

8.2 今后繼續(xù)貫徹落實(shí)國(guó)家強(qiáng)制免疫口蹄疫疫苗的政策， 做到所有養(yǎng)殖場(chǎng)免疫全覆蓋，免疫密度達(dá)到100%。養(yǎng)殖場(chǎng)必須建立健全防疫制度， 重視生物安全管理，加強(qiáng)消毒滅源，規(guī)范引種，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式，采取綜合防控措施，控制口蹄疫的發(fā)生。動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)要加大對(duì)口蹄疫抗體檢測(cè)力度，增加抽樣檢測(cè)點(diǎn)，及時(shí)匯總、分析動(dòng)物疫情和監(jiān)測(cè)流調(diào)信息，定期組織專家開展分析研判和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)口蹄疫強(qiáng)制免疫抗體合格率不達(dá)標(biāo)、免疫失敗的群體，按照有關(guān)免疫規(guī)定督促養(yǎng)殖場(chǎng)戶及時(shí)補(bǔ)免，為縣域口蹄疫防控決策提供技術(shù)支持。