徐宏巖
(阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,安徽阜陽 236000)
玉米赤霉烯酮是玉米赤霉病的代謝產(chǎn)物,又稱為F-2霉素,廣泛存在于小麥、玉米等谷類作物中,是主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物,對(duì)人體和動(dòng)物健康非常不利。玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用,對(duì)雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)破壞性大,可引起動(dòng)物出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等現(xiàn)象。同時(shí),其具有潛在致癌性,可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)及肝腎損傷[1]。
玉米赤霉烯酮分子式為C18H22O5,是一種酚的二羥基苯酸的內(nèi)酯結(jié)構(gòu),不溶于水、四氧化碳和二硫化碳,但能溶于醇類、乙酸乙酯、乙醚和堿性水溶液,微溶于石油醚。目前,對(duì)玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法有生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法、氣相色譜法和高效液相色譜等[2]。本文按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》(GB 5009.209—2016)中的液相色譜法測(cè)定小麥粉中的玉米赤霉烯酮含量,并建立數(shù)學(xué)模型,對(duì)各不確定度分量進(jìn)行評(píng)定。
1.1.1 材料與試劑
實(shí)驗(yàn)用小麥粉樣品為中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供的能力驗(yàn)證樣品;標(biāo)準(zhǔn)品玉米赤霉烯酮(純度≥98.0%,加拿大TRC公司);甲醇;乙腈;氯化鈉;氯化鉀;磷酸氫二鈉;磷酸二氫鉀;葉溫-20;鹽酸;玻璃纖維濾紙(直徑11 cm,孔徑1.5 μm,無熒光特性)。
1.1.2 儀器與設(shè)備
1260高效液相色譜儀(配有熒光檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫公司);ST 8R高速粉碎機(jī)(轉(zhuǎn)速≥12 000 r/min);均質(zhì)器(轉(zhuǎn)速≥12 000 r/min);高速勻質(zhì)器(轉(zhuǎn)速18 000 r/min~22 000 r/min,德國(guó)IKA公司);氮吹儀(美國(guó)ThermosFisher公司);空氣壓力泵;玻璃注射器(10 mL);天平(感量0.000 1 g和0.01 g,瑞士METTLER TOLEDO公司);玉米赤霉烯酮免疫親和柱(柱規(guī)格1 mL或3 mL,柱容量≥1 500 ng,或等效柱)。
1.1.3 試劑配制
①提取液配制。乙腈-水(9+1,V/V)。②PBS清洗緩沖液配制。稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鈉和0.2 g氯化鉀,加入990 mL水將試劑溶解,用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,加水定容至1 L。③PBS/吐溫-20緩沖液配制。稱取8.0 g氯化鈉、1.2 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鈉和0.2 g氯化鉀,加入900 mL水將試劑溶解,用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,加入1 mL吐溫-20,加水定容至1 L[3]。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品放入乙腈中溶解,標(biāo)準(zhǔn)品需精確到0.000 1 g,按照100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,避光保存,溫度在-18 ℃以下。②系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用流動(dòng)相稀釋,配制成10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,避光保存,溫度為4 ℃。③樣本加標(biāo)。稱取小麥粉樣品40 g,加入100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10 mL,混合均勻。
1.2.2 測(cè)定方法
試樣用乙腈溶液提取,經(jīng)免疫親和柱凈化后,使用高效液相色譜熒光檢測(cè)器測(cè)定。小麥粉中玉米赤霉烯酮含量測(cè)定步驟如圖1。
圖1 小麥粉中玉米赤霉烯酮測(cè)定步驟
1.2.3 色譜條件
色 譜 柱:Agilent XDB C18,10 cm×0.3 cm,1.8 μm;流動(dòng)相:乙腈-水-甲醇(46∶46∶8,V/V);流速:0.6 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)274 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:35 ℃。
1.2.4 數(shù)學(xué)模型
玉米赤霉烯酮的含量按公式(1)計(jì)算:
式中:X為試樣中玉米赤霉烯酮的含量,μg/kg;c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得進(jìn)樣液中玉米赤霉烯酮的濃度,ng/mL;V為試樣的定容體積,mL;V1為移入免疫親和柱的濾液體積,mL;m為樣品的質(zhì)量,g。
配制玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)濃度為10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和500 ng/mL,進(jìn)行分析測(cè)試,結(jié)果見表1。根據(jù)表1作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,線性方程為y=6.515×10-4x-7.983,相關(guān)系數(shù)r=0.998 1。將加標(biāo)后的小麥粉樣品在相同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)量6次,測(cè)定結(jié)果見表2。
表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列測(cè)定結(jié)果
表2 樣品重復(fù)性測(cè)定結(jié)果
玉米赤霉烯酮含量的測(cè)定過程包括制備標(biāo)準(zhǔn)液、制備樣品和儀器測(cè)定。測(cè)量不確定度可能來源于玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液校正;玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品純度及樣品稱量;樣品稱量和配制測(cè)量液定容;實(shí)驗(yàn)重復(fù)性測(cè)量等[4]。不確定度來源見圖2。
圖2 小麥粉中玉米赤霉烯酮不確定度來源
繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X,縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y。殘余標(biāo)準(zhǔn)差S和自變量偏差平方和Sxx,計(jì)算公式如下:
測(cè)量樣品溶液6次,由擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值引入的不確定度計(jì)算公式如下:
P=6,根據(jù)表1、表2數(shù)據(jù),計(jì)算得到擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)=0.35%。
(1)標(biāo)準(zhǔn)品純度及稱量引入的不確定度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書,玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣品的純度為100.0 μg/mL,純度偏差為 ±1.2 μg/mL,按照正態(tài)分布估算,取包含因子為2,則標(biāo)準(zhǔn)樣品純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(n)=1.2%。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為液體,無需電子天平稱量,標(biāo)準(zhǔn)品稱量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m1)=0。
(2)使用移液槍定容引入的不確定度。根據(jù)檢定規(guī)程,標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用移液槍移取
液體,取矩形分布。配制過程中使用10 mL移液槍1次和1 mL移液槍7次,移液槍引入的不確定度分量見表3,移液槍引入的相對(duì)不確定度為urel(V1)=1.54%。
表3 移液槍引入的不確定度分量
(1)樣品稱量引入的不確定度。電子天平按照附機(jī)參數(shù)和檢定說明確定線性和重復(fù)性分別為±1 mg,假設(shè)其服從矩形分布[5]。稱量樣品約為40 g,實(shí)際測(cè)量時(shí),使用電子天平進(jìn)行去皮前后2次測(cè)量,測(cè)量結(jié)果強(qiáng)相關(guān),樣品稱量帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m2)=0.004%。
(2)樣品移取與體積定容引入的不確定度。本次實(shí)驗(yàn)使用了2次10 mL移液槍,移液槍引入的相對(duì)不確定度為urel(V)=0.08%。實(shí)驗(yàn)室溫度變化范圍為±5 ℃,水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃,屬于B類不確定度,假設(shè)為矩形分布,實(shí)驗(yàn)室溫度引入的不確定度為u(t)=0.061%。因此,樣品體積引入的相對(duì)不確定度
實(shí)驗(yàn)重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度采用A類評(píng)定。根據(jù)表2數(shù)據(jù),格拉布斯檢驗(yàn)0.95置信水平下無粗大異常值。根據(jù)貝賽爾公式,計(jì)算出6次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差的相對(duì)值為。實(shí)測(cè)時(shí)以雙實(shí)驗(yàn)平均值表示測(cè)量結(jié)果,測(cè)量結(jié)果的A類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
將不確定度的A類評(píng)定結(jié)果和各分量評(píng)估結(jié)果合成,得出相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:
以任意2次測(cè)量結(jié)果平均值為檢測(cè)結(jié)果(如第1次測(cè)量和第5次測(cè)量),玉米赤霉烯酮=19.66 μg/kg,取包含因子k=2,則玉米赤霉烯酮?dú)埩艉康臏y(cè)量結(jié)果及其相對(duì)擴(kuò)展不確定度可表征為=19.66 μg/kg,Urel=12.1%。
通過對(duì)小麥粉中玉米赤霉烯酮不確定度進(jìn)行評(píng)定分析,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度最大,其次為標(biāo)準(zhǔn)品純度及標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度;樣品稱樣和樣品體積定容中10 mL移液槍引入的不確定度較小,在實(shí)際計(jì)算中可忽略不計(jì)。因此,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意重復(fù)性測(cè)量及標(biāo)準(zhǔn)品的選擇,設(shè)置合理的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)規(guī)范操作,在復(fù)雜的樣品處理過程中盡量降低不確定度,提高檢測(cè)精度和質(zhì)量。