垃圾填埋場中不同填埋年限固體廢棄物的抗生素抗性基因污染特征*

李中浤 李曉光 黎佳茜 陳素華

(1.南昌航空大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330063；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院,國家環(huán)境保護(hù)地下水污染過程模擬與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012)

抗生素在醫(yī)學(xué)發(fā)展、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中發(fā)揮著重要的作用[1]，中國作為世界上抗生素最大的生產(chǎn)者和使用者之一，每年生產(chǎn)和消費(fèi)的抗生素分別達(dá)到24.8萬、16.2萬t[2]?？股匾恢贝嬖谶^度使用和長期濫用的現(xiàn)象，過量服用的抗生素會(huì)隨排泄物進(jìn)入環(huán)境，導(dǎo)致環(huán)境中具有抗生素抗性基因(ARGs)和攜帶有抗生素抗性的耐藥菌(ARB)大量增加[3]。隨著越來越多具有多重耐藥性的“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)，抗生素耐藥性對人類健康構(gòu)成了極大的威脅[4]。目前，在城市污水處理廠[5]、湖泊[6]、農(nóng)田土壤[7]、河流[8]、空氣[9]等各類環(huán)境介質(zhì)中均檢測出ARGs[10]。ARGs作為一種新型污染物已成為21世紀(jì)全球公共衛(wèi)生的最大威脅之一[11]。

垃圾填埋場是城市固體廢棄物的最終處置場所，全球垃圾填埋場每年接受約3.5億t城市固體廢棄物，其中大量過期抗生素類藥物會(huì)隨著生活垃圾進(jìn)入垃圾填埋場中，使得城市垃圾填埋場成為抗生素和ARGs的重要“源”和“匯”[12]。除了抗生素外，垃圾填埋場中各種重金屬和有機(jī)污染物的存在也會(huì)影響ARGs和ARB的傳播[13]。WANG等[14]調(diào)查了3個(gè)垃圾填埋場中不同填埋年限的固體廢棄物中抗生素和ARGs濃度，結(jié)果顯示在檢測的15種抗生素中有14種抗生素在填埋年限較短的固體廢棄物中濃度較高，這可能是由于不同抗生素具有不同的物理化學(xué)性質(zhì)，導(dǎo)致在固體廢棄物中的吸附能力有所差異，而且微生物活性和生物降解特征的不同也是導(dǎo)致抗生素濃度出現(xiàn)差異的重要原因之一[15]。相反，在固體廢棄物中檢測出的多種ARGs卻呈現(xiàn)出隨著填埋年限的增加而增高的趨勢。目前關(guān)于垃圾填埋場固體廢棄物ARGs的研究主要是針對磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類等少數(shù)幾種抗生素的ARGs，如sul1、sul2、tetA、tetC、qnrA、qnrB等，無法全面反映垃圾填埋場中ARGs的種類和分布格局。

目前，越來越多的基于脫氧核糖核酸(DNA)的分子生物學(xué)技術(shù)用于檢測和定量分析環(huán)境中的ARGs，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR、熒光定量PCR(qPCR)、高通量PCR和宏基因組測序技術(shù)(mNGS)等[16]。其中，mNGS可克服PCR、qPCR和高通量PCR檢測技術(shù)引物或探針設(shè)計(jì)與選擇的限制，獲得環(huán)境中所有抗性基因的序列信息，并挖掘未知抗性基因的信息[17]，因此mNGS已經(jīng)成為研究環(huán)境中ARGs的有效方法。然而，應(yīng)用該技術(shù)對垃圾填埋場中ARGs的研究卻鮮有報(bào)道。為此，本研究以內(nèi)蒙古巴彥淖爾市的某垃圾填埋場為研究對象，采用mNGS對不同填埋年限固體廢棄物中ARGs的分布規(guī)律和污染水平進(jìn)行分析，以期為固體廢棄物ARGs的污染狀況、擴(kuò)散及傳播規(guī)律研究提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預(yù)處理

內(nèi)蒙古巴彥淖爾市某垃圾填埋場位于臨河城北郊，距市中心7 km，建設(shè)規(guī)模為日處理生活垃圾450 t，設(shè)計(jì)庫容為129.94萬m3。本研究于2020年11月20日分別采集了填埋年限分別為2、5、8年的表層固體廢棄物，-4 ℃冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，使用凍干機(jī)進(jìn)行凍干處理，去除塑料袋、砂石等大顆粒物質(zhì)后進(jìn)行研磨，過40目篩網(wǎng)后置于-40 ℃冰箱冷凍保存，用于DNA提取。

1.2 DNA提取

采用土壤DNA快速提取試劑盒(美國MP)完成固體廢棄物DNA抽提，而后利用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA的純度和完整性，采用Qubit 2.0型熒光光譜儀(美國Thermo Scientific)檢測PCR擴(kuò)增后DNA的產(chǎn)量。基因組DNA樣品用干冰保藏并立即送樣測序，測序平臺(tái)使用NovaSeq 6000(美國illumina)，采用PE150測序策略進(jìn)行雙端測序。

1.3 測序及生物信息學(xué)分析

參考文獻(xiàn)[16]，使用Trimmonatic軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)，得到有效測序數(shù)據(jù)，應(yīng)用USEARCH和BlastX軟件將測序數(shù)據(jù)與構(gòu)化抗生素耐藥基因(SARG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比注釋[18]，對注釋后的數(shù)據(jù)參照SARG數(shù)據(jù)庫將ARGs分成不同的抗性類型，包括氨基糖苷類、桿菌肽類、β-內(nèi)酰胺類、博來霉素類、碳霉素類、氯霉素類、磷霉素類、膦胺霉素類、鐮刀菌酸類、夫西地酸類、春雷霉素類、大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、多黏菌素類、嘌呤霉素類、喹諾酮類、利福霉素類、壯觀霉素類、磺胺類、特曲霉素類、四環(huán)素類、甲氧芐氨嘧啶類、萬古霉素類和未分類。參考文獻(xiàn)[17]，將檢測結(jié)果基于16S拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算出不同抗性類型ARGs的相對豐度。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARGs抗性類型和相對豐度變化

基于SARG數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果，3種固體廢棄中共檢測出21類ARGs，鐮刀菌酸類、夫西地酸類和壯觀霉素類ARGs未檢出。其中填埋2、5、8年的固體廢棄物中分別檢測出19、18、20類ARGs，總相對豐度分別達(dá)3.783×10-1、4.267×10-1、6.741×10-1。碳霉素類、嘌呤霉素類ARGs僅在填埋8年的固體廢棄物中測出；春雷霉素類ARGs在填埋2、5年的固體廢棄物中檢出；特曲霉素類ARGs在填埋2、8年的固體廢棄物中檢出。不同ARGs的相對豐度分布見圖1。

由圖1可見，氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類、利福霉素類、喹諾酮類和甲氧芐氨嘧啶類ARGs的相對豐度均隨著填埋年限的增加而增加，桿菌肽類、未分類ARGs的相對豐度隨填埋年限的增加而降低，相對豐度較高的大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、萬古霉素類ARGs的相對豐度隨填埋年限的增加變化規(guī)律不明顯。甲氧芐氨嘧啶類、磺胺類ARGs隨著填埋年限的增加相對豐度增長比例相對明顯，其中甲氧芐氨嘧啶類ARGs在填埋年限2、8年的固體廢棄物中相對豐度分別為1.325×10-4、6.193×10-3，相對豐度增加了45.74倍。整體相比，填埋8年的固體廢棄物中ARGs的總相對豐度比填埋2年的固體廢棄物增加了2.958×10-1。王柳紅等[19]研究表明垃圾滲濾液年限與ARGs相對豐度呈正相關(guān)，但YU等[20]研究發(fā)現(xiàn)隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs相對豐度會(huì)下降。造成該差異的主要原因可能是垃圾填埋場中ARGs不僅僅與填埋年限有關(guān)，也與垃圾填埋場中重金屬、光照、有機(jī)物、營養(yǎng)鹽以及微生物群落結(jié)構(gòu)等因素變化有關(guān)。

圖1 固體廢棄物中不同ARGs的相對豐度Fig.1 The relative abundance of different ARGs in solid waste

依據(jù)優(yōu)勢ARGs的判斷標(biāo)準(zhǔn)(在樣本組中的相對豐度占比≥1%)，對固體廢棄物中的優(yōu)勢ARGs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。

由表1可見，隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中個(gè)別優(yōu)勢ARGs種類和相對豐度發(fā)生了變化。填埋2年的固體廢棄物中共有11類優(yōu)勢ARGs，豐度占比從大到小依次為大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、萬古霉素類、桿菌肽類、氨基糖苷類、未分類、四環(huán)素類、氯霉素類、膦胺霉素類、磺胺類和利福霉素類；填埋5年的固體廢棄物中共有10類優(yōu)勢ARGs，豐度占比從大到小依次為大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、多藥類、氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺類、桿菌肽類、四環(huán)素類、萬古霉素類、未分類和β-內(nèi)酰胺類；填埋8年的固體廢棄物中共有8類優(yōu)勢ARGs，豐度占比從大到小依次為大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、磺胺類、多藥類、氯霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、萬古霉素類和桿菌肽類。3種固體廢棄物所共有的8類優(yōu)勢ARGs相對豐度占比合計(jì)均在90%以上，是固體廢棄物中最主要的ARGs。ZHAO等[21]通過使用mNGS技術(shù)分析了中國12座城市垃圾填埋廠中ARGs的分布特征，也發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、氨基糖苷類、多藥類和四環(huán)素類是ARGs的主要抗性類型，其相對豐度占比達(dá)到71.1%～93.0%。

表1 固體廢棄物中優(yōu)勢ARGs相對豐度的占比Table 1 The proportion of the relative abundance of advantage ARGs in solid waste %

2.2 ARGs亞型的種類

不同填埋年限的固體廢棄物中共有及特有的ARGs亞型數(shù)目見圖2。

3種固體廢棄物中共檢測出259種ARGs亞型，高于CHI等[22]在醫(yī)廢堆置區(qū)內(nèi)檢測出的ARGs亞型數(shù)。其中填埋2、5、8年的固體廢棄物中分別檢測出160、196、206種ARGs亞型，特有的ARGs亞型分別有12、23、36種，3種固體廢棄物中共有的ARGs亞型有115種，數(shù)目占比達(dá)44.4%。隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs亞型的數(shù)目也隨之增加。填埋2年的固體廢棄物中mefA的相對豐度最高，填埋5、8年的固體廢棄物中均為ermF相對豐度最高，mefA、ermF均屬于大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類ARGs。

圖2 不同填埋年限固體廢棄物中共有和特有的ARGs亞型數(shù)目Fig.2 The number of mutual and unique ARGs subtypes in the solid waste with different ages

抗生素和ARGs廣泛存在于各種環(huán)境媒介中[23]，其中四環(huán)素類和磺胺類ARGs傳播最廣泛，對人體潛在危害最大，也是垃圾填埋場中研究較多的ARGs類型。為此，本研究對不同填埋年限的固體廢棄物中四環(huán)素類和磺胺類ARGs亞型進(jìn)行進(jìn)一步分析。本研究共檢測出4種磺胺類ARGs亞型，分別為sul1、sul2、sul3、sul4。在填埋2、5、8年的固體廢棄物中，磺胺類ARGs相對豐度分別5.031×10-3、2.966×10-2、1.416×10-1，增幅十分明顯。sul2是填埋8年的固體廢棄物中所特有的ARGs亞型，sul1的相對豐度呈現(xiàn)出隨填埋年限的延長而增加的趨勢，而SONG等[24]研究結(jié)果與本研究相反，認(rèn)為sul1的相對豐度與填埋年限呈負(fù)相關(guān)，這可能是不同垃圾填埋場存在一定差異性從而導(dǎo)致個(gè)別ARGs亞型變化趨勢的不同。

3種固體廢棄物中共檢測出27種四環(huán)素類ARGs亞型，其中在填埋2年的固體廢棄物中，四環(huán)素類ARGs相對豐度為1.055×10-2，隨著填埋年限延長到5、8年，四環(huán)素類ARGs相對豐度分別增加到1.954×10-2、5.076×10-2，可能是固體廢棄物中含有一定的四環(huán)素類抗生素殘留，從而產(chǎn)生較大的選擇壓力，有利于四環(huán)素類ARGs的增加和傳播[25]。綜上可知，隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs的豐度以及多樣性均會(huì)隨之增加，從而增加其潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié) 論

(1) 基于mNGS從填埋2、5、8年的固體廢棄物中檢測出19、18、20類ARGs，總相對豐度分別為3.783×10-1、4.267×10-1、6.741×10-1，表明城市生活垃圾填埋場是ARGs的重要儲(chǔ)存庫。

(2) 3種固體廢棄物所共有的8類優(yōu)勢ARGs分別為大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類、磺胺類、多藥類、氯霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、萬古霉素類和桿菌肽類，相對豐度占比合計(jì)均在90%以上，是固體廢棄物中最主要的ARGs。

(3) 固體廢棄物中共檢測出259種ARGs亞型，其中填埋2、5、8年的固體廢棄物中分別檢測出160、196、206種ARGs亞型，相對豐度最高的ARGs亞型均屬于大環(huán)內(nèi)酯-林可胺-鏈霉殺陽菌素類。

(4) 固體廢棄物ARGs中檢測出4種磺胺類和27種四環(huán)素類ARGs亞型。隨著填埋年限的增加，固體廢棄物中ARGs的豐度以及多樣性也會(huì)隨之增加，從而使?jié)撛诃h(huán)境風(fēng)險(xiǎn)逐漸增大。