m6A修飾酶METTL16在卵巢中的表達(dá)及其作用機(jī)理挖掘

Abdelkerim Barh Touna，董 瑩，楊志新，楊麗華

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦科，云南 昆明 650000)

卵巢癌是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，其致死率居?jì)D科惡性腫瘤首位，嚴(yán)重威脅婦女生命和健康。N6-甲基腺苷酸(N6-methyladenosine，m6A)是mRNA和lncRNA中影響RNA代謝的一種重要修飾。甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白16(methyltransferase16，METTL16，又名METT10D)是新近證實(shí)的一種m6A RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，與胃癌[1]、肺癌[2]、前列腺癌[3]等多種癌癥的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，但未見其在卵巢癌中的研究報(bào)道。本研究通過收集Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于METTL16在卵巢癌研究的相關(guān)數(shù)據(jù)集，對(duì)其進(jìn)行探索，同時(shí)通過GEPIA、Kaplan-Meier等數(shù)據(jù)庫(kù)分析METTL16在卵巢癌中的表達(dá)及其對(duì)卵巢癌患者生存的影響，隨后應(yīng)用STRING、Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步探究METTL16共表達(dá)蛋白及其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中提取METTL16在卵巢癌中表達(dá)的數(shù)據(jù)

登陸Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)頁(yè)面(http：//www.on-comine.org)，根據(jù)以下條件進(jìn)行篩選：(1)Gen：METT10D；(2)Cancer Type：Ovarian cancer；(3)Data Type：mRNA；(4)Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；(5)臨界值設(shè)定(P<0.05)；Fold Change：All；Gene Rank：All。探索METTL16在卵巢癌中的差異表達(dá)情況。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證METTL16在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)結(jié)果及其表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理分期的關(guān)系

進(jìn)入GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//gepia.cancer-pku.cn/)，設(shè)置限定條件：(1)Gene：METTL16；(2)p-value Cutoff：0.01；(3)Datasets Selection：OV；(4)匹配正態(tài)數(shù)據(jù)：匹配 TCGA 法線和 GTEx 數(shù)據(jù)。

1.3 應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter進(jìn)行METTL16在卵巢癌中的生存分析

登錄Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//kmplot.com/analysis/)，選擇“start KM plotter for Ovarian cancer”選項(xiàng)卡，設(shè)置限定條件為(1)Gene symbol：METTL16(Affymetrix ID：226744_at)；(2)Survival：無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)、總生存期(Overall survival，OS)。探索METTL16在卵巢癌中的表達(dá)及其對(duì)卵巢癌患者生存的影響。

1.4 METTL16基因相關(guān)蛋白互作關(guān)系及富集分析

登錄STRING主頁(yè)，設(shè)置限定條件：(1)Protein Name：METTL16：(2)Organism：Homo sapiens，構(gòu)建YTHDC1相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。登陸Metacape(https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，設(shè)置限定條件：(1)添加相關(guān)蛋白Gene Symbol；(2)Analysis as species：H.sapiens(121)進(jìn)行相關(guān)蛋白富集分析。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中METTL16在卵巢癌中的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于METTL16在卵巢癌中表達(dá)的相關(guān)研究主要有7項(xiàng)，與正常卵巢組織相比，METTL16在卵巢癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中METTL16在卵巢癌中的表達(dá)及其表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理分期的關(guān)系

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步驗(yàn)證METTL16在卵巢癌組織中的表達(dá)，分析了腫瘤組織426例，正常組織86例，METTL16在卵巢癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，分期越晚表達(dá)越低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、圖3。

圖2：METTL16在卵巢癌組織中的表達(dá)

圖3 METTL16基因表達(dá)與卵巢癌臨床病理分期的關(guān)系

2.3 METTL16基因與卵巢癌患者的生存關(guān)系分析

在Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行卵巢癌患者生存分析，發(fā)現(xiàn)METTL16基因低表達(dá)組無病生存率、總生存率均顯著高于高表達(dá)組(P=0.00024)，見圖4。

圖4 METTL16表達(dá)卵癌患者生存分析

2.4 METT16相關(guān)互作蛋白及其富集分析

在STRING網(wǎng)站中構(gòu)建METTL16基因相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，METTL16主要相關(guān)蛋白有10個(gè)，分別為MEPCE，SGSM2，CLUH，METTL14，SRR，BRMS1L，SMG6，DCP1B，RBM34，METTL3，見圖5。將以上蛋白進(jìn)行富集分析，主要富集在RNA甲基化和mRNA分解代謝過程，見圖6。

圖5 METTL16相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖6 METTL16相關(guān)蛋白參與的富集過程

3 討論

m6A甲基化在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和耐藥性中起到重要作用[4]。METTL16 是人類細(xì)胞 RNA 修飾領(lǐng)域的新興參與者，最初被認(rèn)為是一種核糖體 RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，現(xiàn)有研究顯示它可以結(jié)合并甲基化 MAT2A mRNA和 U6 snRNA[5]，另外METTL16還被證明可以結(jié)合 MALAT1 長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 和其他幾種 RNA[7]。本研究通過在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)METTL16在卵巢癌中表達(dá)明顯低于正常組織，且這一結(jié)果在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了驗(yàn)證，同時(shí)，METTL16與卵巢癌臨床分期各組間有差異，臨床病理分期較早的卵巢癌中表達(dá)更高，且METTL16基因低表達(dá)者無病生存率及總生存率顯著升高，提示METTL16基因在卵巢癌可能發(fā)揮抑癌基因作用。為進(jìn)一步探究METTL16在卵巢癌中的作用機(jī)理，我們發(fā)現(xiàn)MEPCE，METTL13等10個(gè)為METTL16的互作蛋白，進(jìn)行富集分析后發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要富集在RNA甲基化和mRNA分解代謝過程。對(duì)上述10個(gè)蛋白了解后發(fā)現(xiàn)，METTL16與METTL3同源，可以結(jié)合于U6 snRNA，導(dǎo)致U6 核微小核糖核蛋白顆粒(small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNP發(fā)生m6A甲基化修飾，從而影響U6 snRNP對(duì)mRNA前體的剪接[6]，Ma Zhao[7]等人發(fā)現(xiàn)METTL3總體水平升高是子宮內(nèi)膜樣上皮性卵巢癌患者生存期相關(guān)的獨(dú)立因素，Hua[8]等人發(fā)現(xiàn)METTL3通過促進(jìn)AXL(Tyro3/Axl/Mer)的翻譯和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展和/或侵襲性中發(fā)揮重要的致癌作用，而我們的研究中，METTL3與METTL16互為互作蛋白，METTL16在卵巢癌中則表達(dá)為抑癌基因，因此二者可能對(duì)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展起到互相拮抗的作用。

綜合以上結(jié)果及相關(guān)分析，本研究認(rèn)為METTL16可能通過結(jié)合并甲基化mRNA和snRNA干預(yù)mRNA分解代謝過程，同時(shí)通過與METTL3互作蛋白相互拮抗，在METTL16高表達(dá)時(shí)通過干預(yù)RNA甲基化過程抑制METTL3的表達(dá)，使癌細(xì)胞增殖減緩從而發(fā)揮抑癌基因作用。METTL16作為新近證實(shí)的一種m6A RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其在卵巢癌中的作用機(jī)制、臨床意義等，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。