液質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法測定飼料中氯霉素殘留量的不確定度評(píng)估

高俊峰，陳夢(mèng)瑩，邵 瑞，黃 婷

(國糧武漢科學(xué)研究設(shè)計(jì)院有限公司//國家飼料質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心(武漢)，湖北 武漢 430079)

氯霉素是一種常見的廣譜抗生素藥物,曾廣泛用于飼料和養(yǎng)殖行業(yè)[1]。有研究證明，氯霉素能通過食物鏈對(duì)人畜健康造成明顯危害[2]。隨著農(nóng)業(yè)部194號(hào)、250號(hào)公告的發(fā)布，規(guī)定氯霉素類藥物不得在飼料和動(dòng)物源性食品中使用和檢出[3-4]，因此對(duì)氯霉素的準(zhǔn)確檢測很有必要。我們采用液質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法測定飼料中氯霉素殘留量，依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評(píng)定與表示》對(duì)方法的不確定度進(jìn)行分析評(píng)估[5]，以期在實(shí)驗(yàn)過程中控制和避免影響氯霉素含量測定的關(guān)鍵因素，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國賽默飛世爾公司；IKA VORTEX2渦旋混合儀,德國IKA公司；SIGMA 3K15高速冷凍離心機(jī),德國Sigma公司；ASE-12固相萃取儀,天津奧特賽思儀器有限公司；ME104電子天平,瑞士特勒托利多公司；12位氮吹儀,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；0.22 μm有機(jī)濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

氯霉素、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品,北京壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙酸乙酯、甲醇、乙腈、正己烷(色譜純)，美國BCR試劑公司；甲酸、氨水(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑公司；飼料樣品(氯霉素陰性),國家飼料質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心(武漢)；C18固相萃取柱,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作液(100 ng/ml)：使用移液器移取100.0 μg/ml氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑為甲醇)10 μl于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/ml)：使用移液器移取100.0 μg/ml氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶劑為甲醇)10 μl于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備: 使用移液器移取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液和氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作液適量于1 ml容量瓶中，用一級(jí)水配置成氯霉素質(zhì)量濃度分別為1.0、3.0、5.0、10.0和20.0 ng/ml，氯霉素-D5質(zhì)量濃度為10.0 ng/ml的混標(biāo)上機(jī)液。

1.2.2樣品的前處理

參考農(nóng)業(yè)部2483號(hào)公告-8-2016中的檢測方法[6]。平行稱取五份1.1中的飼料樣品，每份2 g(準(zhǔn)確至0.000 1 g)，置于50 ml具蓋離心管中，分別加入100 μl 配制的氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作液、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，再加入0.3 ml氨水、10 ml乙酸乙酯，渦旋2 min后振蕩提取10 min，6 000 r/min離心10 min后提取上清液轉(zhuǎn)入氮吹管中，重復(fù)上述操作1次，合并2次上清液，45℃水浴氮?dú)獯蹈?。向吹干后的殘?jiān)屑尤?%甲醇4 ml復(fù)溶，再加入4 ml經(jīng)甲醇-水飽和過的正己烷除脂2次。取用3 ml甲醇、3 ml水活化過的C18萃取柱，上樣后用3 ml水淋洗，3 ml甲醇洗脫，收集洗脫液于45℃氮?dú)獯蹈?。用單?biāo)線移液管移取1 ml一級(jí)水復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)待測。

1.3 不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型

測定飼料中氯霉素含量的數(shù)學(xué)模型為：

式中，X為飼料樣品中氯霉素殘留量，μg/kg；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出的飼料中氯霉素上機(jī)液測定質(zhì)量濃度，μg/L；V為上機(jī)液最終定容體積，ml；m為飼料樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的評(píng)估

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液操作引入的不確定度

2.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液純度引入的不確定度

查詢標(biāo)準(zhǔn)溶液證書，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液不確定度為3%，k=2，按均勻分布計(jì)算，則2種標(biāo)液的相對(duì)不確定度為：

2.1.1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液配制引入的不確定度

(1)容量瓶引入的不確定度

依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃器皿檢定規(guī)程》[7]，20℃下，1 ml和10 ml的容量瓶引入的不確定度計(jì)算見表1。

表1 容量瓶引入的不確定度

根據(jù)表1可得容量瓶引入的不確定度：

=0.026 517

(2)移液器引入的不確定度

依據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[8]，同時(shí)參考移液器檢定證書，將移液器移取3次10 μl甲醇引入的不確定度計(jì)算如下：

同理可得出1.2.1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程中移液器移取不同體積、不同次數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度，計(jì)算如表2。

表2 10～100 μl移液器引入的不確定度

綜上，移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.1.2樣品前處理引入的不確定度

2.1.2.1稱樣量引入的不確定度

2.1.2.2添加標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)液引入的不確定度

據(jù)1.2.2可知，使用10～100 μl移液器分別向5份氯霉素陰性飼料樣品中添加了氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液和氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)液100 μl，參照表2內(nèi)容，可得添加標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)液引入的相對(duì)不確定度：

2.1.2.3配制上機(jī)液引入的不確定度

由1.2.2可知，配制上機(jī)液使用1 ml單標(biāo)線移液管5次。依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃器皿檢定規(guī)程》[7]，并查詢檢定證書，其不確定度計(jì)算過程匯總?cè)绫?。

表3 1 ml單標(biāo)線移液管引入的不確定度

根據(jù)表3可得1 ml單標(biāo)線移液管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.001 629

2.1.3重復(fù)測定引入的不確定度

依據(jù)CNAS-GL006—2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[9]，重復(fù)測定引入的不確定度按A類評(píng)估，測定的結(jié)果見表4。由表4可得標(biāo)準(zhǔn)偏差：

重復(fù)測定5次氯霉素平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

樣品重復(fù)測定引入的相對(duì)不確定度：

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度值為X軸，氯霉素標(biāo)液與氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜峰面積比值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)5個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行擬合測定，其結(jié)果如表5所示。

根據(jù)表5可得氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合標(biāo)準(zhǔn)差為：

表5 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及計(jì)算結(jié)果

=0.011 860

式中，t為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)(t=5)；Yp代表氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液與氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作液實(shí)測質(zhì)譜峰面積比值；Y代表Ci通過曲線方程計(jì)算出的結(jié)果。由此可得標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.079 631

表4 飼料中氯霉素的重復(fù)測定結(jié)果

綜上，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度：

2.2 合成不確定度

由2.1中各分量不確定度的評(píng)估結(jié)果，得出合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=(0.0152+0.0152+0.026 5172+0.046 2092+0.000 0992+0.078 4852+0.001 6292+

飼料中氯霉素含量平均值為5.006 μg/kg ，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=0.488 μg/kg

2.3 測量不確定度報(bào)告

綜合2.1和2.2所述，依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評(píng)定與表示》[5]，在95%置信概率下取包含因子k=2，測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為：U=2×u(X)=2×0.488=0.976 μg/kg。因此，采用液質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法測定飼料中氯霉素殘留量的結(jié)果表示為：X=(5.01±0.98)μg/kg(k=2)。

3 結(jié)論

我們采用液質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法測定飼料中氯霉素的殘留量，從標(biāo)準(zhǔn)系列溶液操作、樣品前處理、樣品重復(fù)測定、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合四個(gè)方面考慮不確定度的引入及評(píng)定，從最終測量不確定度的報(bào)告結(jié)果看，可以考慮通過選用更高純度標(biāo)準(zhǔn)品和更高精密度的器具，優(yōu)化前處理步驟，提高重復(fù)測定次數(shù)等方面來降低試驗(yàn)結(jié)果的不確定度，從而提高實(shí)驗(yàn)室測定飼料中氯霉素殘留量的準(zhǔn)確度。