微生物遺傳分析的教學(xué)探討

江轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，許 遠(yuǎn)，宋亞玲

遺傳學(xué)的研究內(nèi)容主要有三大部分：遺傳、變異、進(jìn)化.遺傳是變異的基礎(chǔ)，變異是遺傳的發(fā)展，遺傳與變異共同推動著物種的進(jìn)化.遺傳指的是親代與子代之間的相似，而變異指的是親代與子代之間的差異[1-3］.導(dǎo)致生物體發(fā)生性狀變異的原因有多種，如基因突變、基因重組、染色體結(jié)構(gòu)變異、染色體數(shù)目變異，等等.其中基因重組是基于兩個DNA 片段之間的交叉互換而帶來的性狀重新組合.在遺傳學(xué)中，通過計算兩個基因間發(fā)生重組的概率來估計兩個基因間的距離，稱為遺傳分析或者遺傳作圖.在高等動植物中，可通過“兩點測驗”即一次雜交和一次測交確定兩個基因間的距離或“三點測驗”即一次雜交和一次測交確定三個基因間的距離來進(jìn)行遺傳分析[4］.與高等動植物不同，微生物結(jié)構(gòu)較為簡單，多數(shù)進(jìn)行無性生殖，其基因重組及遺傳分析方式也較為特殊，無典型的雜交與測交，學(xué)生在學(xué)習(xí)時會存在很多的誤區(qū)，并且會將高等動植物遺傳分析的方法簡單套用在微生物遺傳分析上.為了明確不同微生物基因重組的實質(zhì)，分析不同微生物基因重組的特點，改良各自遺傳分析的方法，本文以三種典型的微生物（粗糙脈孢霉、噬菌體、枯草桿菌）為例，以基因重組形式為主線，探討并剖析不同類型微生物遺傳分析方式及其基因重組的本質(zhì)，幫助生物學(xué)專業(yè)學(xué)生在遺傳分析中厘清差異，弄清實質(zhì)，舉一反三.

1 粗糙脈孢霉的基因重組及遺傳分析

粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）是一種比較常見的真菌，其體積小，易繁殖，同時可進(jìn)行有性生殖與無性生殖，常作為遺傳學(xué)研究材料[4-5］.一般情況下，粗糙脈孢霉在進(jìn)行有性生殖時會發(fā)生基因重組.粗糙脈孢霉的有性生殖發(fā)生在兩種不同類型的單倍體菌絲體之間（定義為“+”和“-”）.單倍體菌絲體產(chǎn)生的分生孢子染色體數(shù)為7，兩種不同交配型的分生孢子發(fā)生核融合，形成染色體數(shù)為14 的合子，合子經(jīng)減數(shù)分裂與有絲分裂后形成8 個子囊孢子.因子囊太過狹窄，子囊孢子只能按照既定的順序排列在子囊中，稱為順序四分子（圖1）.

圖1 粗糙脈孢霉的有性生殖過程示意圖

粗糙脈孢霉的基因重組常發(fā)生在有性生殖的減數(shù)分裂時期，這與高等動植物一致.遺傳上可通過子囊孢子的排列順序來判斷同源染色體間是否發(fā)生基因重組，稱為四分子分析.若來自同一染色體的兩條姐妹染色單體呈相鄰排列，則認(rèn)為沒有發(fā)生重組或發(fā)生了偶數(shù)次的重組，若來自同一染色體的兩條姐妹染色單體呈交叉排列，則認(rèn)為發(fā)生了奇數(shù)次的重組（圖2）.多數(shù)遺傳學(xué)教材用如下公式來估算粗糙脈孢霉基因的重組率：

圖2 粗糙脈孢霉基因重組示意圖

然而，多次的教學(xué)反饋結(jié)果顯示，大部分學(xué)生無法理解計算公式中乘以二分之一的原因，部分學(xué)生甚至認(rèn)為減數(shù)分裂后的有絲分裂擴(kuò)大了重組率，因而要乘以二分之一.為了更正學(xué)生的誤區(qū)，筆者將上述公式做了如下變形，便于學(xué)生理解.

從圖2 可以看出，單交換可產(chǎn)生重組型子囊孢子，在交換型子囊里有一半是重組型子囊孢子，因此一個交換型子囊中有4 個重組型子囊孢子，4 個非重組型子囊孢子.而不論是交換型子囊還是非交換型子囊，均包含8 個子囊孢子.因此教材公式中的二分之一來源于分子與分母中數(shù)字的比值.

2 噬菌體的基因重組與遺傳分析

噬菌體是一類以細(xì)菌為寄主的病毒，其結(jié)構(gòu)較為簡單，僅包含環(huán)狀DNA 遺傳物質(zhì)及蛋白質(zhì)外殼[6-7］.噬菌體的遺傳基因重組發(fā)生在侵染細(xì)菌階段.如圖3 所示，兩類不同的噬菌體h-r+與h+r-（h，host range mutant，宿主范圍突變型；r，rapid lysis，速溶性）侵染同一宿主，將自身的遺傳物質(zhì)DNA 注入宿主細(xì)胞，并降解宿主DNA.在宿主細(xì)胞內(nèi)，同源區(qū)段發(fā)生交叉重組，此過程類似于真核生物中的非姐妹染色單體交叉互換.同源區(qū)段的基因重組完成后會產(chǎn)生兩種數(shù)量相當(dāng)?shù)闹亟M型（h-r-與h+r+），因此轉(zhuǎn)化后會出現(xiàn)四種不同類型的噬菌斑（h-r+、h+r-、h-r-與h+r+），因此計算交換值時只需將重組型噬菌斑數(shù)（h-r-與h+r+）除以總的噬菌斑數(shù)即可，公式如下：

圖3 噬菌體基因重組示意圖

在某些情況下，兩種重組型噬菌斑只有一種能夠被檢出，在計算交換值時，將檢出的重組型噬菌斑數(shù)量加倍后再除以總的噬菌斑數(shù)以估算交換值.

3 枯草桿菌的基因重組與遺傳分析

與粗糙脈孢霉及噬菌體不同，細(xì)菌的基因重組發(fā)生在線性DNA 片段與環(huán)形DNA 之間，現(xiàn)以黎德伯格的枯草桿菌（Bacillus subtilis）轉(zhuǎn)化實驗說明細(xì)菌基因重組的過程及遺傳分析方法.枯草桿菌可以通過其細(xì)胞膜攝取環(huán)境中的游離DNA 片段，稱為供體DNA，枯草桿菌自身的環(huán)狀DNA 則稱為受體DNA.供體DNA的基因型為色氨酸、組氨酸、絡(luò)氨酸野生型（trp2+his2+tyr1+，+++），受體DNA 為色氨酸、組氨酸、絡(luò)氨酸營養(yǎng)缺陷型（trp2-his2-tyr1-，---）.供體DNA 在DNA 結(jié)合蛋白的協(xié)助下附著在受體細(xì)菌表面的受體位點上，核酸外切酶降解供體雙鏈DNA 中的一條，另一條供體單鏈DNA進(jìn)入受體細(xì)菌內(nèi).供體單鏈DNA 與受體雙鏈環(huán)狀DNA 在同源區(qū)段聯(lián)會，重組并置換受體雙鏈DNA 中的一條，形成供體-受體雜合DNA，而被置換的單鏈DNA 游離于細(xì)菌細(xì)胞中，不久會被降解.雜合DNA 復(fù)制后形成一個重組細(xì)胞和受體細(xì)胞（圖4）.與粗糙脈孢霉及噬菌體不同，在細(xì)菌中僅偶數(shù)次交換有效，而奇數(shù)次交換無效.原因在于線性供體DNA 與環(huán)狀受體DNA 若發(fā)生奇數(shù)次交換，則會導(dǎo)致環(huán)狀受體DNA 開環(huán)，而開環(huán)DNA 在細(xì)菌細(xì)胞中易被降解.

圖4 枯草桿菌基因重組流程示意圖

黎德伯格的枯草桿菌轉(zhuǎn)化實驗是以trp2+his2+tyr1+為供體，trp2-his2-tyr1-為受體，用補(bǔ)充有不同營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行重組細(xì)菌的遺傳篩選，實驗結(jié)果如表1 所示，共篩選出7種不同基因型的重組子，這七種重組子都來源于偶數(shù)次的交換，而trp2-his2-tyr1-在選擇培養(yǎng)基上無法檢出，即使在完全營養(yǎng)型培養(yǎng)基上檢出也無法篩選出參與基因重組的數(shù)量，故在表中沒有列出.從實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，等位基因型轉(zhuǎn)化子數(shù)量上有巨大的差異，如-++//+--，存在有1 000 以上的數(shù)量差，如此巨大的數(shù)量差反映出在細(xì)菌的轉(zhuǎn)化重組中，互為等位基因型的轉(zhuǎn)化子不是在同一次轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生，這與細(xì)菌的轉(zhuǎn)化過程一致即相反的重組子不存在.基于細(xì)菌轉(zhuǎn)化重組的特殊性，筆者設(shè)計了如下的遺傳分析方法：首先根據(jù)親本基因型或重組基因型的數(shù)量推算出其等位基因型的數(shù)量，再依據(jù)數(shù)量的差異推算出不同的交換類型，并定義為交換型I、II、III.而后，可參照“三點測驗”的計算方法來計算基因間的距離.如trp2與his2基因之間的距離為交換型I的比例加上交換型III的比例，為33厘摩，而his2與tyr1基因之間的距離為交換型II的比例加上交換型III的比例，為12厘摩（表2）.此種計算方式與教材中的計算結(jié)果相當(dāng)，而且更容易理解，能達(dá)到前后貫通的效果.

表1trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-（受體）的轉(zhuǎn)化子類型

表2trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-（受體）的重組率計算

4討論

遺傳學(xué)是研究基因間世代傳遞的規(guī)律，而微生物具有世代周期短、后代群體數(shù)量多的特點而備受遺傳學(xué)家青睞[8］.粗糙脈孢霉、噬菌體以及枯草桿菌是其中最為典型的代表，各自的遺傳分析方式既有相似也有差異.相似之處有以下兩點：第一，均是統(tǒng)計單倍體的表型.如在粗糙脈孢霉的遺傳分析中，統(tǒng)計的是不同表型的子囊孢子的數(shù)量而不是子囊的數(shù)量；在噬菌體中統(tǒng)計的是轉(zhuǎn)染后不同表型的子代噬菌體的數(shù)量；在枯草桿菌中統(tǒng)計的是不同類型轉(zhuǎn)化子的數(shù)量.而不論是子囊孢子或是子代噬菌體亦或是轉(zhuǎn)化子本質(zhì)上均是單倍體，即只擁有某物種的一套遺傳物質(zhì).第二，有效重組均能在子代中顯現(xiàn).在單倍體中，所有基因的表型不會被掩蓋，原因在于單倍體中的所有基因均無對應(yīng)的等位基因，無論基因的顯隱性在子代中均能得到反映[9］，基于此，只要發(fā)生有效的基因重組，那么在子代中均能得到顯現(xiàn).差異之處在于以下兩點：第一，發(fā)生重組的DNA形式不同.在粗糙脈孢菌中，基因重組發(fā)生在兩條線性DNA之間，若估算某一基因在基因組上的定位時可以借助著絲粒，把著絲點當(dāng)作一個固定的位點，得到的重組率即為該基因與著絲粒之間的距離.并且，在此背景下，只有奇數(shù)次的交換有效而偶數(shù)次的交換無效，因為偶數(shù)次的交換不會產(chǎn)生有重組表型的子囊.在噬菌體中，重組發(fā)生在兩個環(huán)狀DNA之間.兩個環(huán)狀DNA之間若發(fā)生奇數(shù)次交換，則會發(fā)生融合，形成一個大的環(huán)狀DNA；若發(fā)生偶數(shù)次交換則產(chǎn)生兩個重組型的子代噬菌體.在枯草桿菌中，基因重組發(fā)生在單鏈線性供體DNA與雙鏈環(huán)狀DNA之間.在此背景下，只有偶數(shù)次的交換有效而奇數(shù)次的交換無效，因為奇數(shù)次的交換導(dǎo)致環(huán)狀DNA開環(huán)，開環(huán)的雙鏈DNA在細(xì)菌細(xì)胞中易被降解，無法傳遞至下一代.第二，遺傳分析方式不同.在粗糙脈孢霉中，因每一子囊中只有一半的孢子發(fā)生重組，因此在以子囊數(shù)為統(tǒng)計對象進(jìn)行遺傳分析時，得到的重組率需除以二分之一，否則會使重組率偏大.噬菌體基因重組率的遺傳分析與高等植物中的三點測驗方式一致，即通過不同基因型的數(shù)量判斷交換類型，計算出每種交換類型的數(shù)量來標(biāo)定基因間的順序和距離.而枯草桿菌的遺傳分析方式更為特殊，需根據(jù)某一基因型子代的數(shù)量推斷出其等位基因型子代的數(shù)量再參照三點測驗的方式進(jìn)行基因重組率的計算.

綜上，不同的微生物因其物種特異性或遺傳方式特異性導(dǎo)致了遺傳分析方法有所差異，但需要明確的是，任何物種發(fā)生基因重組的實質(zhì)是相同的，即同源的基因片段發(fā)生交換，而重組值反映的是同源片段間交換的概率[10］.本文將三種典型微生物（粗糙脈孢菌、噬菌體、枯草桿菌）基因重組過程及遺傳分析方式進(jìn)行了細(xì)致地分析，且變形了粗糙脈孢菌遺傳分析計算公式，開發(fā)了枯草桿菌另一遺傳分析方式，比較了三種不同微生物遺傳分析的異同及其本質(zhì)，幫助生物學(xué)專業(yè)學(xué)生辨析差異，靈活運用，融會貫通.