響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取冬凌草甲素工藝及其抗腫瘤活性研究

郭 杰 ，郝 楠，陶 蕾，王吉鴻，陳彥亮，王廣宇

（1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，甘肅 蘭州 730070；2.河南省中藥材生產(chǎn)技術(shù)推廣中心，河南 鄭州 450000）

當(dāng)今，惡性腫瘤因其高死亡率、低治愈率，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)僅2020年新出現(xiàn)的惡性腫瘤患者便高達(dá)1929萬例，其中，我國占23.69%（457萬例），位居全球第一，其治療已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域面對(duì)的重大難題之一[1?3]。由于現(xiàn)階段的治療手段存在損傷正常的機(jī)體組織，導(dǎo)致患者出現(xiàn)免疫力降低、肝腎功能受損或骨髓抑制等不良反應(yīng)[4?6]。所以尋找一種高效、綠色、安全的腫瘤治療藥物已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。冬凌草（Rabdosia rubescens）為唇形科香茶菜屬碎米椏的干燥地上部分，資源在我國甘肅、陜西、河南等黃河流域均有廣泛分布，最早收載于《救荒本草》，現(xiàn)被收載于《中國藥典》[7]。中醫(yī)認(rèn)為冬凌草味苦、甘，性微寒，具有清熱解毒、活血止痛、消炎抑菌和抑制腫瘤等功效，用于治療咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲咬傷等病癥，并對(duì)食管癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、膀耽癌等多種癌癥療效顯著[8]。現(xiàn)代臨床實(shí)驗(yàn)證明，冬凌草通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控癌細(xì)胞周期、改變生物膜的通透性等方式實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制的效果[9]。

冬凌草作為中醫(yī)傳統(tǒng)治療腫瘤的藥物，其有效成分的開發(fā)利用有望為現(xiàn)有的天然活性抗腫瘤藥物研究提供方向，近來年的研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草中的有效成分——冬凌草甲素，因其具有抗腫瘤、抗菌抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用成為當(dāng)今抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)[10]。目前，冬凌草甲素的提取方法主要為索氏提取法、熱回流提取法和溶液浸提法等，這些方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低、能耗大等缺點(diǎn)[11?12]。超聲輔助提取法因其具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉且能有效提高提取效率、縮短提取時(shí)間、降低能耗等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)的提取純化[13?14]。近期針對(duì)冬凌草甲素的研究集中于冬凌草甲素的藥理作用，對(duì)其高效提取方法鮮有研究[15?16]。

本研究立足于冬凌草，采用超聲波法輔助提取冬凌草甲素，以克服傳統(tǒng)浸提法成本高、分離時(shí)間長(zhǎng)、能耗大等缺點(diǎn)。通過單因素確定工藝參數(shù)范圍，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝研究冬凌草甲素高效綠色提取體系，并經(jīng)過對(duì)HepG2細(xì)胞存活率和凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的研究，初步研究冬凌草甲素的體外抗腫瘤活性，以期為天然抗癌物質(zhì)的研發(fā)提取提供理論技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冬凌草 由三門峽廣宇生物制藥有限公司提供，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院中藥材系高致明教授鑒定為正品，自然晾干，干燥密封保存；人肝癌細(xì)胞系HepG2 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（Chian Center for Type Cuture Collection, CCTCC）；冬凌草甲素對(duì)照品（批號(hào) E1526003，純度≥98%） 上海阿拉丁生物科技股份有限公司；Cell counting Kit-8 （CCK-8）試劑盒（批號(hào)202001003）、總蛋白提取試劑盒（批號(hào)201908002）、Caspase-3（批號(hào)202005007）和Caspase-9檢測(cè)試劑盒（批號(hào)202002010） 北京索萊寶科技有限公司；多克隆抗體Caspase-3（批號(hào)2019012006）、β-actin（批號(hào)201806015） 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；甲醇 色譜純，天京永大化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

KQ-250DE超聲波清洗機(jī) 昆山超聲波儀器有限公司；GL21M離心機(jī) 凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 南北儀器有限公司；TY-100L中藥粉碎機(jī) 濟(jì)南天宇專用設(shè)備有限公司；Agilent 1290高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；X-mark酶標(biāo)儀 美國BioRad公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Shellab公司；HX-ZD-100A振蕩儀 華熙昕瑞分析儀器有限公司；DYCZ-24DN電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冬凌草甲素的提取 將冬凌草粉碎，過40目篩，根據(jù)冬凌草甲素的性質(zhì)，依照“相似相容”原理，選擇有機(jī)溶劑乙醇作為萃取劑，結(jié)合以往文獻(xiàn)采用95%的乙醇作為冬凌草甲素的萃取劑[17?18]。稱取1.0 g冬凌草粉末與95%乙醇混合后在超聲作用下提取冬凌草甲素。在一定的超聲條件下處理一定的時(shí)間，離心，收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，揮發(fā)多余乙醇，吸取1 mL用甲醇定容至100 mL，用0.22 μm濾膜過濾，高效液相測(cè)定峰面積。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響 按1.2.1的實(shí)驗(yàn)步驟，設(shè)置不同的料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）在超聲功率為200 W，超聲時(shí)間1 h條件下萃取冬凌草甲素，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算冬凌草甲素得率。

1.2.2.2 超聲功率對(duì)冬凌草甲素得率的影響 按1.2.1的實(shí)驗(yàn)步驟，設(shè)置不同的超聲功率（80、120、160、200、240 W），在料液比為1:20 g/mL，超聲時(shí)間1 h條件下萃取冬凌草甲素，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算冬凌草甲素得率。

1.2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響 按1.2.1的實(shí)驗(yàn)步驟，設(shè)置不同的超聲時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h），在料液比為1:20 g/mL，超聲功率200 W條件下萃取冬凌草甲素，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算冬凌草甲素得率。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定參數(shù)范圍，以冬凌草甲素得率為指標(biāo)，利用Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化料液比、超聲功率及超聲時(shí)間的工藝參數(shù)，評(píng)價(jià)影響冬凌草甲素得率因素的主效應(yīng)、相互效應(yīng)及因素的二次效應(yīng)關(guān)系，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)變量水平Table 1 The levels of variables for the construction of Box-Behnken design (BBD)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用完全二次多項(xiàng)式方程進(jìn)行多元線性回歸擬合，計(jì)算冬凌草甲素得率和各實(shí)驗(yàn)因素之間的函數(shù)關(guān)系。

式中，Y為預(yù)測(cè)的響應(yīng)值，即冬凌草甲素得率；A0是常數(shù)，Ai是線性系數(shù)，Aii是二次方系數(shù)，Aij是交互作用回歸系數(shù)；Xi是自變量。

1.2.4 冬凌草甲素含量測(cè)定

1.2.4.1 色譜條件 Zorbax SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水（50:50），流速：1.0 mL/min，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣體積：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，冬凌草甲素保留時(shí)間14.76 min。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品，95%乙醇溶解，分別配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.4.1的色譜條件，經(jīng)高效液相測(cè)定冬凌草甲素的色譜峰面積。標(biāo)準(zhǔn)曲線的X軸與Y軸分別為對(duì)照品質(zhì)量濃度及峰面積，得回歸式：Y=23.153X?31.569。其中，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996，表明該曲線在0.1～0.8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用于冬凌草提取液中冬凌草甲素質(zhì)量濃度的計(jì)算。

1.2.4.3 冬凌草甲素得率測(cè)定 將1.2.2和1.2.3中制備的冬凌草甲素提取液體，經(jīng)高效液相測(cè)定峰面積，并按如下公式計(jì)算冬凌草甲素的得率。

式中，Y表示冬凌草甲素得率（%）；C為冬凌草甲素濃度（mg/mL）；N為測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù)；V為提取液母液體積（mL）；W為冬凌草原料質(zhì)量（g）。

1.2.5 冬凌草甲素抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響 將長(zhǎng)勢(shì)良好的人肝癌細(xì)胞系HepG2以104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于96孔板，適應(yīng)生長(zhǎng)12 h后，棄去原培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基0.9 mL，分別加入40、80、120、160、200 μmol/L冬凌草甲素溶液0.1 mL，配成終濃度為4、8、12、16、20 μmol/L冬凌草甲素溶液（冬凌草甲素分子量為364.44，HPLC測(cè)定的提取液中冬凌草甲素量0.412 mg/mL，將提取液稀釋56.5倍配置20 μmol/L冬凌草甲素母液），作用24 h后，將10 μL CCK-8檢測(cè)液逐一加入各孔，1 h后酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)其OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中，S表示細(xì)胞存活率（%）；As為試驗(yàn)孔的吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8和藥物溶液）；Ac為對(duì)照孔的吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基和CCK-8溶液）；Ab為空白孔的吸光度（含培養(yǎng)基和CCK-8溶液）。

1.2.5.2 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞胞內(nèi)凋亡蛋白的影響 5×105/mL HepG2細(xì)胞 接種于6孔板，貼壁培養(yǎng)12 h，棄去原培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基2.7 mL，分別加入40、80、120、160、200 μmol/L冬凌草甲素溶液0.3 mL，配成終濃度為4、8、12、16、20 μmol/L冬凌草甲素溶液。37 °C含5% CO2濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞刮板刮下，離心收集細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液在冰浴條件振蕩裂解，細(xì)胞裂解液使用總蛋白提取試劑盒測(cè)定蛋白含量，Capase-3和Capase-9活性嚴(yán)格按照Capase-3和Capase-9活性測(cè)定試劑盒執(zhí)行。

Western blotting檢測(cè)Capase-3凋亡蛋白表達(dá)水平，取長(zhǎng)勢(shì)良好的HepG2細(xì)胞，D-hank`s清洗后加入細(xì)胞裂解液，依總蛋白提取試劑盒操作指導(dǎo)提取總蛋白。蛋白變性后取等量各組總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。待電泳前端溴酚藍(lán)至分離膠下緣時(shí)停止電泳，進(jìn)行1 h轉(zhuǎn)膜。將完成轉(zhuǎn)膜的PVDF膜以含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫下封閉2 h。將封閉好的PVDF膜與一抗（Caspase-3，1:1000；βactin，1:1000）于4 ℃孵育過夜。次日取出后用TBST洗膜3次，加入二抗（1:1000）室溫下置于搖床平緩晃動(dòng)，孵育1 h。結(jié)束后以TBST洗膜3次后加入顯色液覆蓋整張膜，進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，運(yùn)用Origin 9.0繪制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相關(guān)圖片，采用SPSS 18.0和Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響 如圖1所示，在1:10～1:20 g/mL的料液比范圍內(nèi)，冬凌草甲素得率逐漸升高，在料液比為1:20 g/mL時(shí)冬凌草甲素得率達(dá)到最高，之后得率不再隨料液比的增加而增加。此現(xiàn)象可能是由于溶質(zhì)和萃取劑的接觸面積隨著液料比的增加而擴(kuò)大，更有利于冬凌草甲素的萃取[19?20]；但料液比超過1:20 g/mL后，溶質(zhì)已經(jīng)達(dá)到了溶解平衡，所以得率不再增加，考慮到提取成本，液料比選擇1:20 g/mL作為冬凌草甲素提取的最佳提取參數(shù)。

圖1 料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響Fig.1 Effect of liquid to solid ratio on yield of oridonin

2.1.2 超聲功率對(duì)冬凌草甲素得率的影響 如圖2所示。超聲功率在80～200 W范圍內(nèi)，冬凌草甲素得率隨超聲功率的升高而增加，此后繼續(xù)增加超聲功率，冬凌草甲素得率增高不明顯，考慮到提取成本，超聲功率為200 W作為冬凌草甲素提取的最佳提取參數(shù)。

圖2 超聲功率對(duì)冬凌草甲素得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of oridonin

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響見圖3，提取時(shí)間在1.0 h以內(nèi)，冬凌草甲素得率隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)急速增加；在提取時(shí)間1.0～1.5 h范圍內(nèi)，冬凌草甲素得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢增加；提取時(shí)間超過1.5 h以后增加趨勢(shì)不明顯。其原因可能是冬凌草甲素隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，部分冬凌草甲素氧化分解[21]，所以在時(shí)間超過1.5 h后冬凌草甲素得率會(huì)略有所下降。因此，選擇1.5 h為冬凌草甲素最佳的超聲時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)冬凌草甲素得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of oridonin

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 表2顯示了Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)17個(gè)3因素和3水平的結(jié)果。使用SAS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，冬凌草甲素得率和試驗(yàn)變量采用以下二次多項(xiàng)式方程得出：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

式中，Y為冬凌草甲素得率，A為料液比，B為超聲時(shí)間，C為超聲功率。

經(jīng)Design-Expert 8.0軟件ANOVA法分析響應(yīng)表面二次多項(xiàng)式模型的顯著性。實(shí)驗(yàn)方差結(jié)果分析如表3所示，回歸模型的擬合極顯著（P<0.01），實(shí)驗(yàn)復(fù)相關(guān)系數(shù)（R2）是0.9329和校正測(cè)定系數(shù)（R2adj）是0.8467，失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），以上結(jié)果均表明模型擬合程度高可靠性強(qiáng)，觀察值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性良好，在實(shí)驗(yàn)變量范圍內(nèi)具有很高的顯著性，可用該模型來分析和預(yù)測(cè)冬凌草甲素的提取條件，此外，低變異系數(shù)（CV）為4.23%表示模型的精度高。以上結(jié)果證實(shí)選用試驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，可以用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。表3結(jié)果顯示，所選各因素水平范圍內(nèi)，一次項(xiàng)A達(dá)到極顯著水平（P<0.01），C達(dá)到了顯著水平（P<0.05），表明料液比對(duì)冬凌草甲素得率的影響最大，要得到良好的響應(yīng)值必須嚴(yán)格控制好料液比。各項(xiàng)因素對(duì)冬凌草甲素的影響大小順序是：料液比（A）>超聲功率（C）>超聲時(shí)間（B）。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of regression model

根據(jù)多元回歸方程做出不同處理因素對(duì)冬凌草甲素得率影響相應(yīng)三維響應(yīng)面和二維等高線如圖4所示。三維響應(yīng)面闡釋了當(dāng)其他因素保持在零水平不變時(shí)，因變量之間的關(guān)系和兩個(gè)測(cè)試變量之間的相互作用[22?23]，二維等值線圖的形狀反映了變量之間的交互效應(yīng)，圓圖表示試驗(yàn)參數(shù)相互作用影響不顯著，而橢圓輪廓圖表示試驗(yàn)參數(shù)相互作用影響顯著[24?25]。圖4B呈現(xiàn)出料液比和超聲功率間顯著的交互作用，由此可知，冬凌草甲素得率與料液比、超聲功率密切相關(guān)；圖4C顯示，等高線在超聲功率軸向分布密集且呈陡然變化趨勢(shì)，但其在超聲時(shí)間軸向分布稀疏且變化趨勢(shì)較為緩和，該結(jié)果提示，冬凌草甲素得率受超聲功率的影響大于超聲時(shí)間的影響。以上結(jié)果均可支持方差分析結(jié)果。

圖4 不同處理因素交互作用對(duì)冬凌草甲素得率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour plots of the interactive effects on the yield of oridonin

2.2.2 最優(yōu)工藝條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0軟件分析優(yōu)化冬凌草甲素提取的最佳條件：料液比為1:17.73 g/mL，超聲時(shí)間為1.51 h，超聲功率為189.06 W。最佳條件下，冬凌草甲素預(yù)測(cè)最高得率為4.154%。為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，兼顧實(shí)際操作的便利性，將上述最佳提取條件修正為，料液比為1:18 g/mL，超聲時(shí)間為1.5 h，超聲功率為190 W進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。3次平行實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)得冬凌草甲素得率為（4.122%±0.102%），證實(shí)了預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的良好相關(guān)性，表明該模型適用于冬凌草甲素的提取。

2.3 冬凌草甲素抗腫瘤作用

2.3.1 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響 冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞存活率的影響如圖5所示。冬凌草甲素處理組HepG2細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組明顯下降，其中，當(dāng)冬凌草甲素濃度超過8 μmol/L之后，對(duì)肝癌細(xì)胞的存活率抑制與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），在4～20 μmol/L的范圍內(nèi)具有劑量依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率低至60.72%。

圖5 冬凌草甲素對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effect of oridonin on HepG2 cells viability

2.3.2 凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞胞內(nèi)凋亡蛋白的影響冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Caspase-3和Caspase-9活性的影響如圖6所示。與空白對(duì)照組相比，冬凌草甲素組細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性明顯上升，說明冬凌草甲素通過激活Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。其中，冬凌草甲素濃度達(dá)到8 μmol/L以后肝癌細(xì)胞HepG2的Caspase-3和Caspase-9活性顯著上升（P<0.05），且表現(xiàn)出良好的劑量依賴性。

圖6 冬凌草甲素對(duì)HepG2細(xì)胞Caspase-3（A）和Caspase-9（B）活性的影響Fig.6 Effect of oridonin on Caspase-3（A） and Caspase-9（B） activity

應(yīng)用Western-Blot技術(shù)分析檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 Caspase-3蛋白表達(dá)的影響（如圖7）?；叶葤呙瓒糠治鼋Y(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度冬凌草甲素處理后Caspase-3蛋白表達(dá)的變化。不同濃度冬凌草甲素處理24 h后，與對(duì)照組相比，加入冬凌草甲素處理后，Caspase-3的表達(dá)量隨冬凌草甲素濃度的增加顯著增加，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；當(dāng)冬凌草甲素濃度大于8 μmol/L后，Caspase-3的表達(dá)較對(duì)照組極顯著升高（P<0.01），說明冬凌草甲素作用24 h在一定濃度時(shí)可以激活Caspase-3的表達(dá)。

圖7 冬凌草甲素對(duì)HepG2細(xì)胞Caspase-3表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of oridonin on Caspase-3 expression in HepG2 cells

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，冬凌草甲素作用于HepG2細(xì)胞后，通過增加Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，降低細(xì)胞存活率，暗示此時(shí)HepG2細(xì)胞因細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)引起細(xì)胞數(shù)目的下降，說明冬凌草甲素能通過促進(jìn)線粒體途徑介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞的目的。

3 討論與結(jié)論

冬凌草甲素是中草藥植物冬凌草的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，冬凌草甲素因具有多種生物活性而受到廣泛關(guān)注。冬凌草甲素常用的提取方法研究集中于熱回流提取法、滲漉法、索氏提取法等，由于冬凌草甲素為熱敏成分，這些提取方法存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低，降低生物活性等缺點(diǎn)。所以積極尋找更加適合提取冬凌草甲素的方法，可以更好地促進(jìn)我國冬凌草植物資源的高值化利用。超聲輔助提取法因其具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉并且能有效提高提取效率、縮短提取時(shí)間、降低能耗等優(yōu)點(diǎn)[26]，可克服傳統(tǒng)浸提法分離時(shí)間長(zhǎng)、易失活、能耗大等缺點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提取。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取冬凌草甲素的工藝參數(shù)，料液比為1:18 g/mL，超聲時(shí)間為1.5 h，超聲功率為190 W的條件下，冬凌草甲素得率達(dá)到4.122%。

冬凌草甲素的抗腫瘤活性是通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、調(diào)整細(xì)胞周期、改變生物膜的通透性等方面實(shí)現(xiàn)的?，F(xiàn)已證實(shí)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase）家族在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中起著十分重要的作用[27]。其中，Capase-3是觸發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心蛋白酶，是所有細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路蛋白，其過量表達(dá)就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28?29]。許多的細(xì)胞凋亡通路都是經(jīng)過線粒體完成的，所以線粒體也稱之為“自殺武器儲(chǔ)存庫”[30?31]。大量文獻(xiàn)報(bào)道在線粒體凋亡途徑中，首先破壞了線粒體的氧化呼吸鏈，繼而引起電子解偶聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基，最終觸發(fā)ATP損失和細(xì)胞色素C釋放，最終激活凋亡蛋白Caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[30,32?34]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，冬凌草甲素可以大幅降低HepG2細(xì)胞的存活率，增加Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)，通過促進(jìn)線粒體途徑介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞數(shù)目的目的。