重組細(xì)菌活載體疫苗研究進(jìn)展

陳妍卉，劉軍亭，于 潛，劉久源，裴翊峰，龐富生，高棟鵬，董 浩,2*

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開(kāi)發(fā)教育部工程研究中心/生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

目前，動(dòng)物傳染病的防治主要依賴于疫苗，而疫苗主要采用減毒疫苗或滅活疫苗。雖然減毒疫苗和滅活疫苗的研制技術(shù)成熟，但仍有較多的不足之處。減毒疫苗是選擇具有活性的無(wú)毒或毒力較弱的非致病性病原體所制成的疫苗，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，但在接種后可能會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象[1]。因此，出于安全考慮，預(yù)防疾病一般首選滅活疫苗，但滅活疫苗在滅活后可能出現(xiàn)病毒滅活不全的現(xiàn)象。其次，病毒中和抗原決定簇可能在疫苗滅活時(shí)被破壞，難以中和抗體，免疫效果不如減毒疫苗[2-3]。綜上所述，如何制備一種高效率并且安全的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的疫苗引起了越來(lái)越多研究學(xué)者的關(guān)注。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)等深入研究，基因工程技術(shù)快速發(fā)展，疫苗研究方向逐漸從減毒疫苗和滅活疫苗過(guò)渡至基因工程疫苗。相比于傳統(tǒng)疫苗，基因工程疫苗能夠有效的誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答?；蚬こ桃呙缰饕藖唵挝灰呙?、合成肽疫苗和活載體疫苗[4]。

1950 年，Stasney 等發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的染色質(zhì)中存在一段可以導(dǎo)致腫瘤惡化的基因，通過(guò)質(zhì)?？蓪⑦@段基因轉(zhuǎn)移到正常真核細(xì)胞中表達(dá)，表明所分離的DNA 可以傳遞給正常細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)[5]，該發(fā)現(xiàn)為活載體疫苗的研究奠定基礎(chǔ)?；钶d體疫苗是將病毒或細(xì)菌作為遞呈載體，相比于減毒疫苗或滅活疫苗，該類(lèi)疫苗免疫效果更佳，并且可以插入多個(gè)外源基因，達(dá)到一針?lè)蓝嗖〉男Ч；钶d體疫苗在防治動(dòng)物傳染病和腫瘤等方面，具有良好的應(yīng)用前景，逐漸成為當(dāng)今疫苗研發(fā)的主要方向。本文從細(xì)菌活載體疫苗在預(yù)防疾病的優(yōu)劣勢(shì)、基本原理以及近年來(lái)的研究進(jìn)展等方面概述，并針對(duì)目前常用的幾種細(xì)菌活載體的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，為細(xì)菌活載體疫苗的研發(fā)提供參考。

1 細(xì)菌活載體疫苗概述

活載體疫苗主要包括病毒活載體疫苗和細(xì)菌活載體疫苗。目前用于病毒活載體疫苗的載體主要有腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘病毒等。而用于細(xì)菌活載體疫苗的載體主要包括乳酸菌、卡介苗、沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌（E. coli）等。1980 年，Schaffner首次發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重組E. coli和哺乳動(dòng)物細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，E.coli中攜帶的猴空泡病毒40（Simian Virus 40，SV40 virus）基因組能夠從E. coli中傳遞至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中[6]。1999 年，F(xiàn)enelly 等構(gòu)建攜帶麻疹病毒基因組的減毒鏈球菌菌株，通過(guò)鼻飼免疫能在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定定植，并引起機(jī)體體內(nèi)Th1 型和Th2 型免疫應(yīng)答[7]。Shat 等將攜帶人類(lèi)免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）基因的減毒福氏志賀菌，鼻飼免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)減毒福氏志賀菌能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[8]。這幾個(gè)發(fā)現(xiàn)為細(xì)菌活載體疫苗的研究提供了新的方向和思路。

細(xì)菌活載體疫苗是一種新型疫苗，在過(guò)去十多年間發(fā)展快速。目前，以減毒傷寒沙門(mén)氏菌為遞呈載體的活載體疫苗應(yīng)用最為廣泛，免疫后在機(jī)體內(nèi)能大量表達(dá)外源基因，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫。除了減毒傷寒沙門(mén)氏菌外，乳酸菌作為一種食品級(jí)益生菌也被廣泛用于新型疫苗的研發(fā)中。

2 細(xì)菌活載體疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)

近幾年，研究學(xué)者所制備的細(xì)菌活載體疫苗對(duì)豬鏈球菌2 型（SS2）、豬瘟、新城疫等動(dòng)物疾病均獲得了較好的預(yù)防效果。不僅在動(dòng)物疾病上，細(xì)菌活載體疫苗還在HIV、乙肝病毒、寄生蟲(chóng)等人類(lèi)疾病的防制領(lǐng)域被視為候選疫苗之一。

以細(xì)菌為遞呈載體的活載體疫苗在免疫方式、菌株培養(yǎng)、遞呈基因等方面有較多優(yōu)勢(shì)[9-10]，但在免疫過(guò)程中仍有不足之處，還需進(jìn)一步的研究。首先，一些減毒的細(xì)菌在免疫機(jī)體后可能會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象，危害機(jī)體健康[11]。其次，由于細(xì)菌活載體疫苗免疫效率較低，因此需要長(zhǎng)期試驗(yàn)從而確定最佳免疫劑量和免疫周期來(lái)提高免疫效率。并且細(xì)菌活載體疫苗在免疫過(guò)程中對(duì)其免疫抗原可能具有一定的耐受性，導(dǎo)致免疫效果不佳，無(wú)法誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前，細(xì)菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗作為主要的活載體疫苗種類(lèi)，在預(yù)防疾病方面均有不同的優(yōu)缺點(diǎn)（表1），應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇最優(yōu)最適合的活載體疫苗種類(lèi)，將其免疫效果發(fā)揮至最佳水平。

表1 病毒活載體疫苗與細(xì)菌活載體疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)

3 重組細(xì)菌活載體疫苗的基本原理

構(gòu)建重組細(xì)菌活載體疫苗的方式主要有以下兩種：（1）將外源基因插入至細(xì)菌染色體中；（2）將外源基因插入至細(xì)菌質(zhì)粒中。所構(gòu)建的重組細(xì)菌活載體疫苗通過(guò)口服或鼻飼免疫的方式進(jìn)入機(jī)體消化道，進(jìn)而在腸道中穩(wěn)定定植。細(xì)胞中的高爾基體邊緣凸起形成的初級(jí)囊泡，將細(xì)菌包裹在囊泡里遞呈至溶酶體中。溶酶體分泌水解酶溶解細(xì)菌，暴露出攜帶遺傳信息的質(zhì)粒，隨后通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并在細(xì)胞核中將其抗原轉(zhuǎn)錄翻譯后遞呈至T 淋巴細(xì)胞，從而引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。

例如沙門(mén)氏菌攜帶含有抗原的質(zhì)粒進(jìn)入機(jī)體后，從腸道轉(zhuǎn)移至腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）中的抗原遞呈細(xì)胞（Antigen-presenting cell，APC）中，進(jìn)而形成含沙門(mén)氏菌的囊泡。在囊泡的中沙門(mén)氏菌仍保持其活性，并且不斷增殖，隨后重組抗原通過(guò)沙門(mén)氏菌遞呈至宿主細(xì)胞胞質(zhì)中，避免腸道中的酶類(lèi)對(duì)抗原的降解作用，進(jìn)而引起機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫[12]。沙門(mén)氏菌具有兩個(gè)III 型分泌系統(tǒng)，分別為SPI1-T3SS 和SPI12-T3SS[13]。其中SPI1-T3SS 分泌系統(tǒng)可以促進(jìn)沙門(mén)氏菌侵入非吞噬細(xì)胞。SPI12-T3SS分泌系統(tǒng)可將經(jīng)過(guò)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）加工后的沙門(mén)氏菌遞呈至FliC 表位，從而刺激CD4+T 細(xì)胞的增殖和IFN-γ 的分泌，進(jìn)而引起機(jī)體的細(xì)胞、體液或黏膜免疫[14]。

重組乳酸桿菌進(jìn)入機(jī)體后能夠在胃腸道中穩(wěn)定定植，一般通過(guò)兩種途徑激活機(jī)體黏膜免疫系統(tǒng)（圖1）。一種是重組乳酸桿菌被腸道上皮細(xì)胞中緊密連接的樹(shù)突狀細(xì)胞所識(shí)別，加工后遞呈抗原。另一種為體內(nèi)派爾集合淋巴結(jié)（Peyer′s patch）中的M 細(xì)胞識(shí)別重組乳酸桿菌，將抗原遞呈至細(xì)胞基底外側(cè)的抗原遞呈細(xì)胞中，從而激活CD4+T 細(xì)胞增殖和漿細(xì)胞分泌大量sIgA，引起機(jī)體產(chǎn)生全身性免疫應(yīng)答和局部黏膜免疫應(yīng)答[15]。

圖1 重組乳酸桿菌誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)

4 重組細(xì)菌活載體疫苗研究進(jìn)展

4.1 乳酸菌活載體疫苗研究進(jìn)展乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一種在發(fā)酵的過(guò)程中利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，通常以球菌或桿菌的形式存在[16]。乳酸菌普遍存在于日常環(huán)境和機(jī)體的胃腸道中，具有調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群和維持腸道穩(wěn)態(tài)并誘導(dǎo)機(jī)體黏膜免疫的功能[17]。

相比減毒疫苗和滅活疫苗，重組乳酸菌疫苗能夠遞呈抗原并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，廣泛應(yīng)用于多種體外實(shí)驗(yàn)中[18]。同時(shí)重組乳酸菌能夠在人體腸道中持續(xù)定植，長(zhǎng)期釋放特異性抗原蛋白引起機(jī)體免疫反應(yīng)[19]。

Wang 等將構(gòu)建的pSIP409-dRVG 電轉(zhuǎn)至植物乳桿菌NC8 中，口服免疫小鼠后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)IgG 抗體含量相比于對(duì)照組顯著升高，Th1/Th2 比值升高，釋放細(xì)胞因子，提高了機(jī)體抵抗狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）的免疫力[20]。Wang 等將NC8-pSIP409-pgsA-mIL4 免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)sIgA、IL-4 和IL-10 的含量均高于對(duì)照組，在接種旋毛形線蟲(chóng)后能誘導(dǎo)脾臟、腸道中CD3+、CD4+T 細(xì)胞大量增殖，誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫。并且NC8-pSIP409-pgsA-mIL4 還能引起機(jī)體Th2 顯性反應(yīng)，起到一定預(yù)防作用[21]。Wang 等對(duì)構(gòu)建的LceGFP-VP60進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在攻毒后重組干酪乳桿菌組幼兔的存活率為100%，體內(nèi)sIgA 含量均高于PBS 組和滅活疫苗組。并且PBS 組和滅活疫苗組的小腸絨毛壞死同時(shí)有嚴(yán)重脫皮現(xiàn)象，而重組干酪乳桿菌組并未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，證明重組干酪乳桿菌對(duì)腸道環(huán)境有一定的保護(hù)作用[22]。Zhang 和Kong 研究團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建重組Lc-pPG-1-OmpAI、Lc-pPG-2-OmpAI、Lc-pPG-1-flaB 和Lc-pPG-2-flaB，免疫鯉魚(yú)后，發(fā)現(xiàn)鯉魚(yú)體內(nèi)溶菌酶、SOD、ACP活性均高于對(duì)照組。提取各組織RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組織中的IL-1β、IL-10和TNF-α顯著上調(diào)，證明重組干酪乳桿菌能誘導(dǎo)鯉魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫，提高鯉魚(yú)免疫力，有良好的免疫保護(hù)效果[23-24]。

4.2 沙門(mén)氏菌活載體疫苗研究進(jìn)展沙門(mén)氏菌（Salmonella）是一種革蘭氏陰性菌，有2 500 多種血清型，能夠致多種動(dòng)物或人的腸胃炎，甚至引起全身性發(fā)熱直至死亡[25-26]。沙門(mén)氏菌在減毒后通過(guò)口服免疫的途徑將抗原遞呈至宿主細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[14,27]。目前國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者將沙門(mén)氏菌作為一種遞呈載體用于研制不同疾病的新型疫苗，均獲得了不同程度的成效，是一種較為成熟且極具應(yīng)用前景的活載體。

Ty21a 是第一種減毒傷寒沙門(mén)氏菌疫苗，通過(guò)紫外線和化學(xué)法使沙門(mén)氏菌中g(shù)alE基因發(fā)生突變從而達(dá)到減毒效果[28]。Ty21a 能引起機(jī)體分泌IFN-γ 和全身性CD4+和CD8+T 細(xì)胞的增殖，并且能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgA 和IgG 抗體[29]。Li 等發(fā)現(xiàn)帶saoA基因的重組減毒腸炎沙門(mén)氏菌rSC0016 和rSC0012 能夠引起機(jī)體較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，對(duì)SS2 的感染有良好的預(yù)防效果[30-31]。Chin′ombe 等將沙門(mén)氏菌作為HIV-1 抗原疫苗載體，免疫小鼠后引發(fā)機(jī)體特異性Th1 和Th2 細(xì)胞因子反應(yīng)[32]。Bachtiar 等證明重組沙門(mén)氏菌疫苗可以將HIV-1 抗原遞呈至免疫系統(tǒng)，以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HIV-1 特異性免疫反應(yīng)[33]。Zhi 等使用輻射突變技術(shù)（Radiation mutation technology，RMT）獲得一株減毒性沙門(mén)氏桿菌KST0666，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)所獲得的減毒性沙門(mén)氏桿菌可有效的將口蹄疫（FMD）抗原遞呈至免疫細(xì)胞中，并能引起機(jī)體體內(nèi)IgM、IgG 及IgA 的增加從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及黏膜免疫反應(yīng)，同時(shí)分泌大量IFN-γ、IL-5 和IL-17A，引起機(jī)體產(chǎn)生特異性Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞因子反應(yīng)，為FMD 疫苗的研究提供新思路[34]。

4.3 卡介苗活載體疫苗研究進(jìn)展卡介苗（Bacillus Calmette-Guérinrr，BCG）是一種由Albert Calmette 和Camille Guérin 開(kāi)發(fā)的減毒牛分枝桿菌菌株，目前作為一種相對(duì)有效的疫苗被廣泛應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核?。═uberculosis，TB）中[35]。除此之外，以卡介苗作為載體，導(dǎo)入外源性基因，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)，在乙型肝炎、百日咳、弓形蟲(chóng)病等傳染病中均有較大的突破[36]。

時(shí)坤等構(gòu)建rBCG-pMV61-BVDV E2 重組質(zhì)粒，通過(guò)頸部皮下注射的方式免疫奶牛，發(fā)現(xiàn)rBCG 能夠誘導(dǎo)免疫組奶牛IFN-γ 的分泌、體內(nèi)CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞的增殖及機(jī)體細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[37]。于艷輝等將扁菱形蛋白（Rhomboid）與豬IL-2 基因串聯(lián)后，構(gòu)建pMV261-Rho-IL-2 重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)入BCG 中，免疫后免疫組體內(nèi)IL-2、IFN-γ 和IL-12的表達(dá)水平均明顯提高，證明rBCG 能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)豬弓形蟲(chóng)病起到了一定的預(yù)防作用[38]。Wang 等將構(gòu)建的pMV361-rho 和pMV361-rho-IL2 電轉(zhuǎn)至BCG 中，鼻飼免疫后發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，免疫組體內(nèi)CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞大量增殖，誘導(dǎo)了機(jī)體細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)了抵抗球蟲(chóng)感染的能力[39]。羅文武等將犬IL-2 與弓形蟲(chóng)Rhomboid 蛋白同時(shí)構(gòu)建于pMV261 載體中，并電轉(zhuǎn)至BCG 中，免疫后通過(guò)ELISA 測(cè)得免疫組犬血清中IL-2、IFN-γ 和TNF-α 的含量隨免疫次數(shù)增加而增加，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了Th1 細(xì)胞應(yīng)答，并且相比于對(duì)照組，在感染弓形蟲(chóng)后免疫組的存活時(shí)間有所延長(zhǎng)，對(duì)犬弓形蟲(chóng)病有一定的預(yù)防作用[40]。李文超將rBCG/pMV261-IFN-γ-AMA1 滴鼻免疫雛雞后，機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，并且rBCG/pMV261-IFN-γ-AMA1 的免疫效果要優(yōu)于rBCG/pMV261-AMA1 的免疫效果，證明了IFN-γ 在重組卡介苗中會(huì)增強(qiáng)巨型艾美耳球蟲(chóng)中AMA1 蛋白（Apical membrane antigen）的免疫保護(hù)效力[41]。

4.4 E. coli活載體疫苗研究進(jìn)展大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli），俗稱(chēng)大腸桿菌，是一種革蘭氏陰性菌。具有生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單快捷的特點(diǎn)，并且重組質(zhì)粒能穩(wěn)定保存于E. coli中。目前，以E. coli為遞呈載體的活載體疫苗引起了研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。

如今已發(fā)現(xiàn)E. coli有多個(gè)種類(lèi)，部分E. coli菌株對(duì)機(jī)體具有一定的益生效果，同時(shí)E. coli能夠在機(jī)體腸道中穩(wěn)定定植，進(jìn)而刺激機(jī)體的體液免疫反應(yīng)。劉文鑫通過(guò)構(gòu)建ER-A 和ER-B 兩種重組E. coli作為豬源腸致病性E. coli的口服疫苗，使其分別表達(dá)兩種嵌合毒素LT192-STa13 和LT192-STb。將兩種重組E. coli口服免疫動(dòng)物后，分別在免疫組血清、脾臟、腸黏液和腸系膜淋巴結(jié)中均檢測(cè)到sIgA 和IgG 抗體，證明所構(gòu)建的重組E. coli口服疫苗不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體局部的免疫應(yīng)答還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性的體液免疫應(yīng)答。重組E. coli具有良好的遺傳穩(wěn)定性、消化道穩(wěn)定定植能力、對(duì)消化環(huán)境良好的耐受性以及對(duì)動(dòng)物的良好免疫保護(hù)效果，可作為E. coli性仔豬腹瀉口服減毒活載體疫苗的候選菌株之一[42]。Ruan 等通過(guò)構(gòu)建faeG-fedF-ltb 嵌合基因，并轉(zhuǎn)入E. coli中表達(dá)后免疫仔豬，發(fā)現(xiàn)免疫組血清、糞便懸液、腸道洗滌液中均檢測(cè)到IgG 和IgA 抗體，證明所構(gòu)建的重組E. coli對(duì)于豬產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）具有良好的免疫保護(hù)效果，可以作為開(kāi)發(fā)豬ETCE 減毒活疫苗的理想候選菌株，并為研發(fā)人類(lèi)ETEC 疫苗或其他腸道疾病疫苗提供新思路[43]。丁仕豪等人將得到的INP-rMAP62-54c/BL21E. coli免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫組體內(nèi)的CD4+T 細(xì)胞在免疫后2 周內(nèi)快速大量增殖，免疫后在2 周～4 周CD8+T 細(xì)胞的含量也有所增加，并且在攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)相比于兩組對(duì)照組，免疫組體內(nèi)的IFN-γ 分泌量上升而IL-10 的含量有所下降，說(shuō)明以E. coli為遞呈載體的重組蛋白能夠引起機(jī)體較好的免疫反應(yīng)，這一結(jié)果為新型副結(jié)核疫苗的研發(fā)提供了一個(gè)新的方向[44]。

4.5 其他細(xì)菌活載體疫苗研究進(jìn)展除了以上所提及的細(xì)菌活載體疫苗外，李斯特菌（Listeria ivanovii）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）等細(xì)菌也廣泛用于活載體疫苗的構(gòu)建。

Wang 等將B. subtilis-P97R1 和B. subtilis-P46 通過(guò)鼻飼途徑免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)sIgA、IgG 及T 細(xì)胞的分泌均高于對(duì)照組，證明重組枯草芽孢桿菌可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部的黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)豬肺炎支原體的感染有一定的預(yù)防作用[45]。Zhang 等將重組B. subtilis-Cap 通過(guò)口服的方式對(duì)仔豬免疫后發(fā)現(xiàn)仔豬體內(nèi)IgA、IgG 的含量有所增加，并在仔豬的腸道中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)IEL、CD3+和CD4+T 淋巴細(xì)胞含量均高于對(duì)照組，而IL-1β，IL-6 和IFN-γ 的分泌以及TLR2 和TLR9 的表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)，證明重組枯草芽孢桿菌可以引發(fā)機(jī)體黏膜免疫反應(yīng)，為豬圓環(huán)病毒2 型新型疫苗的研究提供一個(gè)全新的方向[46]。

李斯特菌作為一種革蘭氏陽(yáng)性菌，攜帶抗原進(jìn)入細(xì)胞后可通過(guò)MHCⅠ類(lèi)分子和MHCⅡ分子將抗原加工遞呈至CD8+和CD4+T 細(xì)胞。并且可將其細(xì)胞壁表面蛋白和Toll 樣受體與APC 結(jié)合來(lái)增強(qiáng)抗原遞呈作用。該菌可作為一種理想的候選載體用于動(dòng)物疾病、人類(lèi)疾病和癌癥等活載體疫苗的研制[47-48]，Mahdy 等通過(guò)構(gòu)建pCW154-vp1 并電轉(zhuǎn)至減毒李斯特菌中，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)IgG 抗體的含量高于對(duì)照組。重組李斯特菌不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體CD4+T 細(xì)胞的增殖還可以誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞的增殖，相比于傳統(tǒng)的FMD 疫苗具有良好的免疫效果[49]。Eung-Jun 等發(fā)現(xiàn)相比于DNA 疫苗，以重組李斯特菌為遞呈載體的活載體疫苗可以有效誘導(dǎo)機(jī)體CD8+T細(xì)胞的增殖顯著升高，更好的引起機(jī)體黏膜反應(yīng)。并且相比于傳統(tǒng)的皮下注射DNA 疫苗的方式，口服重組李斯特菌能夠減輕動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)并且更適用于資源匱乏的地區(qū)[50]。

5 小結(jié)及展望

當(dāng)今許多動(dòng)物疾病具有極高的死亡率與極強(qiáng)的傳染性，如新城疫、FMD、小鵝瘟等，給中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。不僅如此，還有許多新型疾病的出現(xiàn)如非洲豬瘟、新型禽流感均給中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大威脅。而如今傳統(tǒng)的疫苗研制技術(shù)雖然成熟但仍有許多不足之處。難以解決由于減毒疫苗毒力返強(qiáng)給動(dòng)物機(jī)體帶來(lái)的嚴(yán)重后果，也無(wú)法大幅提高滅活疫苗的免疫效果，更無(wú)法減輕動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)。因此，新型疫苗的研究迫在眉睫。尤其近十幾年，新型疫苗研制引起了人們的廣泛關(guān)注，而新型疫苗研制技術(shù)也在這十幾年間快速發(fā)展。而細(xì)菌活載體疫苗由于其免疫方式方便快捷，并能引起機(jī)體持久性的免疫應(yīng)答等一系列優(yōu)勢(shì)得到了更為廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。

以細(xì)菌為遞呈載體，通過(guò)口服或鼻飼的方式將重組蛋白遞呈至黏膜組織，從而誘導(dǎo)機(jī)體黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。相比于皮下注射的傳統(tǒng)疫苗，重組細(xì)菌活載體疫苗可通過(guò)口服或鼻飼的方式在機(jī)體腸道中穩(wěn)定定植，操作簡(jiǎn)單并且成本較低。而細(xì)菌可以將DNA 直接遞呈至細(xì)胞內(nèi)部，避免核酸酶對(duì)其的降解。不僅如此，細(xì)菌進(jìn)入機(jī)體后還可以作為一個(gè)天然的抗原，起到調(diào)節(jié)機(jī)體先天性免疫和促進(jìn)特異性免疫反應(yīng)的作用。

如今重組細(xì)菌活載體疫苗在預(yù)防和治療動(dòng)物傳染病和腫瘤等均取得了較好的效果。但如何提高重組活載體疫苗的免疫效率、降低由于染色體整合帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，從而得到更安全、高效和低價(jià)的活載體疫苗，仍然需要更多研究學(xué)者的不懈努力，這也是眾多研究學(xué)者今后研究的新方向。