中華倒刺鲃致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定、耐藥性及毒力基因檢測(cè)

高金偉，田 興，謝 敏，李紹明，袁希平，鄧時(shí)銘，宋 銳

（湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410153）

中華倒刺鲃（Spinibarbus sinensis），隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鲃亞科（Barbinae）、倒刺鲃屬（Spinibarbus），俗稱青波、巖鯽、烏鱗等，是我國(guó)長(zhǎng)江流域特有的大型名貴經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。中華倒刺鲃以肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮腴肥美、營(yíng)養(yǎng)豐富而著稱，具有個(gè)體大、食譜廣、生長(zhǎng)快、適溫范圍廣、易馴養(yǎng)、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，適宜于池塘、水庫(kù)和規(guī)?；B(yǎng)殖，備受消費(fèi)者和水產(chǎn)養(yǎng)殖者的青睞，已成為我國(guó)淡水水域的重要養(yǎng)殖品種之一[1]。近年來(lái)，由于極大的市場(chǎng)需求和良好的經(jīng)濟(jì)前景的刺激，中華倒刺鲃的養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度不斷提高，加之養(yǎng)殖環(huán)境惡化、管理操作不當(dāng)、種質(zhì)退化等原因，導(dǎo)致中華倒刺鲃的抗病力下降，病害的暴發(fā)日益嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了中華倒刺鲃養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展壯大。目前，中華倒刺鲃的疾病有細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲(chóng)性疾病等，其中細(xì)菌性疾病是危害最為嚴(yán)重、影響最為廣泛的一類(lèi)疾病，極大地影響了中華倒刺鲃的養(yǎng)殖效益。前期的研究報(bào)道了中華倒刺鲃肌肉潰爛病、細(xì)菌性爛鰓病、細(xì)菌性腸炎病、出血病等細(xì)菌性疾病[2-3]，其中中華倒刺鲃肌肉潰爛病的病原為伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderid）中的洋蔥霍爾德氏菌（Burkhol cepacid），而其余3 種細(xì)菌性疾病的病原仍未明確。此外，袁旦一等報(bào)道了一例維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）混合感染導(dǎo)致的中華倒刺鲃持續(xù)性死亡的病例[4]。朱成科等報(bào)道了患病中華倒刺鲃的致病菌為遲緩愛(ài)德華菌（Edwadsiella tarda）[5]。目前，國(guó)內(nèi)外僅有少數(shù)關(guān)于中華倒刺鲃致病菌的研究報(bào)道[2-5]，而關(guān)于池塘養(yǎng)殖的中華倒刺鲃致病性嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）的分離鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道。

2019 年6 月湖南省長(zhǎng)沙市某水產(chǎn)養(yǎng)殖基地池塘套養(yǎng)的中華倒刺鲃大量死亡，其他混養(yǎng)品種（草魚(yú)、鰱、鳙）未見(jiàn)死亡，病魚(yú)的臨床癥狀主要為體表出血，鱗片少量脫落，肛門(mén)脫垂紅腫，剖檢見(jiàn)淡黃色至淡紅色腹水，脾、腎腫大，鰾上有出血點(diǎn)，腸道無(wú)內(nèi)容物。通過(guò)鏡檢排除真菌及寄生蟲(chóng)感染。本研究對(duì)患病的中華倒刺鲃進(jìn)行了病原菌分離鑒定，進(jìn)而檢測(cè)其攜帶的毒力基因和耐藥性，旨在分析該菌的分類(lèi)地位、致病力并篩選防治藥物，以期為深入研究中華倒刺鲃病原多樣性、嗜水氣單胞菌的致病機(jī)理、傳播途徑及流行病學(xué)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料瀕死中華倒刺鲃采自湖南省長(zhǎng)沙市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量（327.2±29.7）g，體長(zhǎng)（28.6±1.83）cm。健康中華倒刺鲃取自湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所長(zhǎng)沙基地，體質(zhì)量（300±25.1）g，體長(zhǎng)（25.2±3.28），暫養(yǎng)于長(zhǎng)（320 cm）×寬（155 cm）×高（80 cm）的水泥池中，水溫（28±1）℃，24 h 連續(xù)增氧，暫養(yǎng)1 周后用于人工感染試驗(yàn)。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、氣單胞菌培養(yǎng)基（RS）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、MH 瓊脂（MHA）、LB 瓊脂和哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；革蘭氏染色液、藥敏紙片和生化鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；ExTaq?試劑盒和DL2000 Marker 購(gòu)自寶生物技術(shù)（北京）有限公司；Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒和瓊脂粉購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 細(xì)菌的分離與純化在無(wú)菌條件下用接種環(huán)從患病中華倒刺鲃肝胰臟、脾臟和腎臟的新鮮斷面及腹水中取樣劃線，接種于TSA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)18 h后挑取單菌落接種于TSB 培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)18 h 后，于TSA 培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的菌株。共獲得4 株形態(tài)、大小基本一致的單克隆菌，依次編號(hào)為AH32～AH35，4 ℃保存?zhèn)溆谩＿x取AH32 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)菌形態(tài)特征觀察和生化鑒定取純培養(yǎng)菌AH32 經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。將該菌株接種于RS、NA、LB、哥倫比亞血瓊脂等平板上，置于28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌株生長(zhǎng)情況。將該菌株無(wú)菌接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，測(cè)定其生理生化特性。

1.4 細(xì)菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建提取分離菌株基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?6S rRNA基因序列的PCR 擴(kuò)增引物及體系參照梁利國(guó)等的方法進(jìn)行[6]。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。利用SeqMan 軟件進(jìn)行分離菌株16S rRNA 基因序列拼接。利用NCBI 的BLASTn 檢索系統(tǒng)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析16S rRNA 基因序列的同源性，并利用ClusterX 1.83 軟件對(duì)14 株同源性較高的16S rRNA 基因序列進(jìn)行多重比對(duì)，再利用MEGA7 軟件包中Neighbour-Joining 法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 分離菌的多位點(diǎn)序列分型參照文獻(xiàn)合成gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA6 個(gè)管家基因的擴(kuò)增引物[7]，并將分離菌DNA 作為模板分別PCR 擴(kuò)增6個(gè)管家基因，PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)得的管家基因序列利用SeqMan軟件拼接，并在線上傳至https://pubmlst.org/aeromonas/數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，得到每個(gè)管家基因的等位基因號(hào)，按照gyrB-groL-gltA-metG-ppsA-recA的順序?qū)⒌任换蛱?hào)排列可得到該分離菌的序列型（Sequence type，ST），即多位點(diǎn)序列型。

1.6 分離菌毒力基因檢測(cè)選取氣單胞菌屬（Aeromonas）中6種常見(jiàn)毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1），包括氣溶素（aer）、熱不穩(wěn)定腸毒素（alt）、黏附素（aha）、彈性蛋白酶（ela）、脂肪酶（lip）和蛋白酶（ahp），PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃5 min；94 ℃45 s、退火30 s（退火溫度見(jiàn)表1）、72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。

表1 嗜水氣單胞菌毒力因子的檢測(cè)引物Table 1 Primers of the virulence genes in Aeromonas hydrophila

1.7 藥物敏感試驗(yàn)采用K-B 紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株AH32 進(jìn)行30 種常用抗生素的耐藥性檢測(cè)。以涂布法接種0.1 mL濃度為1×108cfu/mL（約0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋┑腁H32 菌液于MH 瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察并記錄抑菌圈的直徑（包括藥敏片），參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）發(fā)布的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)指南和中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-抗菌藥物敏感性試驗(yàn)技術(shù)要求（WS/T 639-2018），以抑菌圈直徑大小作為分離菌株對(duì)藥物敏感性的判定依據(jù)。將分離菌AH32 對(duì)每種抗生素的耐藥情況用S、I、R 記錄，計(jì)算該菌的多重耐藥指數(shù)（Multi-antibiotic resistance indexes，MARIs）。

1.8 動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)挑取AH32 單克隆于LB 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)（28 ℃，180 r/min），離心，棄上清，用0.9%的無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，制成菌懸液，采用紫外分光光度計(jì)法（OD600nm）測(cè)定菌懸液的濃度，將菌懸液分別10倍倍比稀釋至1×109cfu/mL～1×105cfu/mL。將中華倒刺鲃隨機(jī)分成18 組，每組10 尾魚(yú)，5 個(gè)不同稀釋度的菌液隨機(jī)選取3 組腹腔注射0.1 mL 菌懸液，設(shè)為感染組；剩余3 組魚(yú)腹腔注射0.1 mL 無(wú)菌生理鹽水，設(shè)為對(duì)照組。連續(xù)7 d 記錄并觀察實(shí)驗(yàn)魚(yú)的發(fā)病和死亡情況，同時(shí)從瀕死的中華倒刺鲃的內(nèi)臟器官進(jìn)行病原菌的重分離，以引起人工感染的中華倒刺鲃發(fā)病死亡并能重新分離到相同的病原菌作為分離菌致病性的判定依據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離菌形態(tài)特征和理化特性分析患病魚(yú)的病料樣品接種TSA 培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h 后形成邊緣濕潤(rùn)、表面光滑、中央微凸起、直徑約2 mm、灰白色或淡黃色的圓形菌落。分離菌在NA 和LB 瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征與在TSA 瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)基本一致，在RS 培養(yǎng)基上呈橙黃色。在哥倫比亞血瓊脂平板（含5%脫脂綿羊血）上生長(zhǎng)良好，產(chǎn)生β-溶血圈。AH32 株為革蘭氏陰性短桿菌，能夠利用葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽、七葉苷等，不能利用乳糖、蜜二糖、尿素等；分解賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶。

2.2 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析PCR擴(kuò)增AH32株的16SrRNA片段長(zhǎng)度為1368bp（MW440455）。將其通過(guò)EZBio Cloud 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果與嗜水氣單胞菌16S rRNA 基因序列同源性高達(dá)99.78%；進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，菌株AH32 與嗜水氣單胞菌（NR_043638、NR_074841、NR_113342）聚為一支（圖1）。

圖1 分離菌AH32 16S rRNA基因發(fā)育的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 The phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence of AH32

綜合分離菌株的表型特征、理化特性及16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，判定分離菌AH32 為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌。

2.3 多位點(diǎn)序列分型與毒力基因檢測(cè)結(jié)果分離株AH32 管家基因的PCR 結(jié)果顯示，獲得與6 個(gè)管家基因片段大小對(duì)應(yīng)的單一亮條帶（圖2A），對(duì)PCR 產(chǎn)物序列在線比對(duì)，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌AH32 的等位基因圖譜為210-214-122-211-221-217，其序列型為ST251。菌株AH32 可檢測(cè)到alt、aha、ela、lip和ahp毒力基因（圖2B），檢出率為83.3%，其毒力基因型為alt+aer-aha+ahp+lip+ela+。上述結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌AH32 攜帶多個(gè)與致病相關(guān)的毒力基因，且屬于高致病性序列型ST251。

圖2 分離株AH32的管家基因（A）和毒力基因（B）PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of housekeeping genes(A)and virulence genes(B)of isolated strain AH32

研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌ST251 型是引起中國(guó)和美國(guó)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥的高風(fēng)險(xiǎn)序列型，能夠?qū)Φ~(yú)類(lèi)的養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8]。在中國(guó)，ST251 型菌株已成為江蘇、湖南、湖北、廣東等省份的主要流行菌株，其感染宿主主要為鯉科魚(yú)類(lèi)[8-9]。本研究中， ST251 型嗜水氣單胞菌致中華倒刺鲃的大量死亡，再次說(shuō)明ST251 型嗜水氣單胞菌在湖南地區(qū)池塘養(yǎng)殖的鯉科魚(yú)類(lèi)中廣泛傳播。

致病菌表達(dá)和分泌毒力因子，進(jìn)而侵入、定植和損傷宿主，檢測(cè)致病菌的毒力基因是評(píng)估其潛在致病性的重要手段。本研究中，嗜水氣單胞菌AH32 攜帶毒力基因aha、alt、ahp、lip和ela，未攜帶毒力基因aer，表明嗜水氣單胞菌AH32 對(duì)中華倒刺鲃產(chǎn)生的致病性可能與其分泌的外毒素密切相關(guān)，至于其致病機(jī)理與外毒素的相關(guān)性有待進(jìn)一步探究。黃沙鱉源嗜水氣單胞菌的Alt和ahal基因與Aer、ahp等毒力基因之間存在協(xié)同作用，且毒力基因型為hly+Aer-Alt+Act+ahal-ahp+的嗜水氣單胞菌致病力顯著低于hly+Aer+Alt+Act+ahal-ahp+的菌株[10]。劉小芳等指出，魚(yú)源嗜水氣單胞菌的alt、aer、lip等毒力基因與嗜水氣單胞菌的致病力呈正相關(guān)，且是否攜帶aer基因不作為氣單胞菌致病力強(qiáng)弱的判定依據(jù)[11]。由此表明，嗜水氣單胞菌毒力的強(qiáng)弱依賴于其毒力因子的合成與分泌，其毒力的發(fā)揮是多種毒力基因協(xié)同作用的結(jié)果，且與其攜帶毒力基因的種類(lèi)、數(shù)量以及毒力基因的表達(dá)情況密切相關(guān)。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果分離菌AH32 對(duì)頭孢他啶、頭孢曲松、多西環(huán)素等19 種抗生素敏感，對(duì)鏈霉素、紅霉素、美羅培南中度敏感，對(duì)氨芐西林、頭孢拉定、克林霉素等8 種抗生素耐藥。分離菌AH32 的MARIs 為0.33。以上結(jié)果表明，分離菌AH32 對(duì)所選用的抗生素具有一定的耐藥性。

目前，抗菌藥物依然是水產(chǎn)動(dòng)物疾病控制的主要手段之一，但由于抗菌藥物的不合理使用、耐藥菌株的傳播及耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物致病菌的耐藥性問(wèn)題日益突出。本研究中，分離株AH32 對(duì)第一代頭孢類(lèi)抗生素頭孢拉定高度耐藥，對(duì)頭孢曲松、頭孢吡肟等第三代和第四代頭孢類(lèi)抗生素高度敏感，這與蔡麗娟等在草魚(yú)、鯽、團(tuán)頭魴等魚(yú)源嗜氣單胞菌的藥敏結(jié)果一致[12]，而與鱘源嗜水氣單胞菌對(duì)上述頭孢類(lèi)藥物均高度耐藥的研究結(jié)果不一致[13]，表明嗜水氣單胞菌不同分離株對(duì)抗菌藥物的耐藥性存在差異，這可能與養(yǎng)殖品種、養(yǎng)殖環(huán)境、用藥習(xí)慣、給藥途徑等因素密切相關(guān)。目前，藥敏試驗(yàn)仍然是篩選敏感性高、療效確定抗菌藥的重要手段。本研究中，嗜水氣單胞菌AH32 對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、左氧氟沙星等19 種抗菌藥物敏感。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020 年2 號(hào)》文件中指出，氟苯尼考、恩諾沙星和多西環(huán)素為已批準(zhǔn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥，因此在中華倒刺鲃養(yǎng)殖過(guò)程中，可選用這3 種藥物防治。

2.5 人工感染試驗(yàn)結(jié)果將健康中華倒刺鲃經(jīng)腹腔注射分離菌株AH32 后，接種不同濃度菌液后出現(xiàn)不同程度的死亡，且隨著菌懸液濃度的增加，其死亡率呈上升趨勢(shì)；對(duì)照組中華倒刺鲃在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡。接種24 h 后，1×109cfu/mL 濃度組的實(shí)驗(yàn)魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)死亡，胸鰭基部明顯出血，肛門(mén)紅腫，癥狀與自然發(fā)病的中華倒刺鲃臨床癥狀一致。從感染死亡的魚(yú)體肝臟、腎臟及腹水中再次分離純化到感染菌，經(jīng)細(xì)菌學(xué)特征鑒定，其性狀與原菌株AH32 一致。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌AH32 是該次中華倒刺鲃死亡的致病菌。

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科（Vibrionaceae）、氣單胞菌屬，普遍存在于土壤、養(yǎng)殖水體和水生動(dòng)物腸道中，是典型的人-獸-魚(yú)共患條件致病菌。近年來(lái)，先后從青魚(yú)（Mylopharyngod piceus）[6]、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[7]等不同的鯉科魚(yú)類(lèi)體內(nèi)分離鑒定出嗜水氣單胞菌，本研究首次從患病中華倒刺鲃體內(nèi)分離獲得嗜水氣單胞菌，表明嗜水氣單胞菌對(duì)水生動(dòng)物宿主的廣泛適應(yīng)性及其宿主范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大。