豬鏈球菌三價(jià)滅活苗的制備及對小鼠免疫效果的評價(jià)

崔麗榮，王嘉珍，李 亮，何長生，邢 剛，劉雪蘭，孫 裴，魏建忠，李 郁*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 合肥 230091；3.馬鞍山史記動(dòng)物健康管理有限公司，安徽 馬鞍山 238251）

豬鏈球菌病是由鏈球菌屬中豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）、馬鏈球菌類馬亞種、馬鏈球菌獸疫亞種和蘭氏分群中D、E、L 群鏈球菌引起的一種常見豬傳染病。其中，SS 是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病最主要的病原。在SS 已知的35 種血清型中，以血清2 型（Streptococcus suisserotype 2，SS2）分離率最高，致病力最強(qiáng)[1]。然而，近年來血清3 型（Streptococcus suisserotype 3，SS3）和血清4 型（Streptococcus suisserotype 4，SS4）在國內(nèi)外發(fā)病豬中均較為普遍且分離率呈逐年上升的態(tài)勢，甚至成為局部地區(qū)的優(yōu)勢血清型[2-6]。本實(shí)驗(yàn)室于2018 年～2020 年對安徽、江蘇、山東、河北、廣西等地區(qū)發(fā)病豬細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，SS2 分離率最高，其次是SS4 和SS3。

一直以來抗生素是養(yǎng)殖企業(yè)治療豬鏈球菌病的主要手段，但長期不合理的濫用亂用，致使SS 耐藥問題日趨嚴(yán)重[7]。在當(dāng)前全面開展減抗、限抗并逐步朝向禁抗的大趨勢下，疫苗免疫則成為預(yù)防豬鏈球菌病的有效措施。目前已有的商用SS 疫苗主要針對SS2 和SS7（Streptococcus suisserotype 7，SS7），尚未有SS3 和SS4 疫苗。由于SS 血清型眾多，不同血清型菌株之間缺乏交互免疫力，流行血清型的分布情況也隨著地理區(qū)域不同而有所變化，所以在生產(chǎn)實(shí)際中常會(huì)出現(xiàn)疫苗接種后免疫效果不確實(shí)的現(xiàn)象。滅活苗憑借其使用安全，研制周期短，易于保存及運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)在臨床上普遍應(yīng)用，而多價(jià)滅活苗能對多種血清型菌株產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。因此，開展SS 多價(jià)滅活苗的研制意義顯著。

本研究將篩選出的3 株用于制備疫苗的SS 菌株（代號/血清型分別為HF2/SS2，BB15-4/SS3，HBgu18-4/SS4）經(jīng)甲醛滅活后、以ISA 201VG 礦物油佐劑進(jìn)行配比乳化，制備滅活前為1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 種活菌濃度的SS 三價(jià)（血清2、3、4 型）滅活苗，進(jìn)而以昆明鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行免疫效果評價(jià)，同時(shí)與SS 商用疫苗作平行比較，為新型SS 三價(jià)滅活苗的研發(fā)提供技術(shù)儲(chǔ)備，為有效防控豬鏈球菌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、疫苗及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SS2、SS3 和SS4 疫苗用菌株代號分別為HF2、BB15-4、HBgu18-4，攻毒菌株代號分別為BZ1、BB15-4、HBgu18-4，均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室篩選與保存[8-9]（表1）；豬鏈球菌病三價(jià)滅活疫苗（C 群XS 株、SS2 LT 株和SS7 YZ 株）購自武漢科前生物股份有限公司（生產(chǎn)批號：20200406）；體質(zhì)量為18 g～22 g、6 周齡～8 周齡清潔級雌性昆明鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

表1 菌株的背景信息Table 1 Background information of Streptococcus suis strains used in this study

1.2 主要試劑酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂（TSAYE）、酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）均購自紹興天恒生物科技有限公司；礦物油佐劑ISA 201VG購自法國賽比克公司；甲醛溶液購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；小鼠脾臟組織淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購自美國博士德生物工程有限公司；細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒（IL-4、IL-10、IFN-γ、TFN-β、MCP-1）購自美國RB 公司；流式細(xì)胞抗體試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.3 SS 三價(jià)（血清2、3、4 型）滅活苗的制備與檢驗(yàn)將3 株制苗菌株培養(yǎng)液中的活菌數(shù)均分別調(diào)整為1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 種濃度后細(xì)菌滅活，其中SS2、SS3 試驗(yàn)菌株（HF2、BB15-4）用終濃度為0.3%的甲醛、37 ℃條件下滅活15 h，SS4 試驗(yàn)菌株（HBgu18-4）用終濃度為0.15%的甲醛、37 ℃條件下滅活11 h。以ISA 201VG礦物油佐劑配比乳化，制備3 種活菌濃度的SS 三價(jià)滅活苗，依次命名V-a、V-b 和V-c，待疫苗檢驗(yàn)合格后[10]，利用昆明鼠進(jìn)行免疫效果評價(jià)。

1.4 昆明鼠分組及免疫將190 只小鼠，隨機(jī)分成6 組（編號分別為A、B、C、D、E、F）。其中A～D組為免疫組（每組35 只小鼠），依次免疫V-a、V-b、V-c、商用疫苗；E、F 組分別為攻毒對照組（35 只小鼠）和陰性對照組（15 只小鼠），均接種等體積滅菌生理鹽水。接種劑量均為0.2 mL/只，接種途徑均為頸部皮下多點(diǎn)注射。接種2 次，間隔14 d。

1.5 各組小鼠血清中IgG 抗體檢測于首免后14 d與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，每組3只。用全菌體超聲裂解物包被酶標(biāo)板，參照文獻(xiàn)[11]中的ELISA 方法檢測HF2（SS2）、BB15-4（SS3）、HBgu18-4（SS4）免疫小鼠后血清中的IgG 抗體效價(jià)。

1.6 各組小鼠的血清殺菌試驗(yàn)于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，每組3 只，血清經(jīng)56 ℃熱處理30 min 為滅活補(bǔ)體。免疫組為小鼠血清+健康豚鼠血清（補(bǔ)體）+菌懸液（分別為BZ1、BB15-4、HBgu18-4，以生長菌落數(shù)為100 cfu～200 cfu的菌液稀釋濃度為試驗(yàn)菌懸液濃度。下同）；抗體對照組為小鼠血清＋健康豚鼠血清（滅活補(bǔ)體）+菌懸液；補(bǔ)體對照組為PBS 稀釋液+健康豚鼠血清（補(bǔ)體）+菌懸液；體系對照組為PBS 稀釋液+健康豚鼠血清（滅活補(bǔ)體）+菌懸液。各組置37 ℃孵育1 h 后，涂布于TSA-YE 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，殺菌率（%）=[1-免疫組菌落數(shù)/補(bǔ)體對照組菌落數(shù)]×100%，若免疫組孔內(nèi)菌落的數(shù)量為補(bǔ)體對照孔的50%以下即判為“殺菌”，否則判為“不殺菌”。

1.7 各組小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量的測定于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，每組3 只。利用相應(yīng)細(xì)胞因子試劑盒對各組小鼠產(chǎn)生的白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子β（TNF-β）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的細(xì)胞因子含量進(jìn)行檢測。

1.8 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)首免14 d 和二免7 d 后，采集各免疫組和陰性對照組小鼠，每組3只。將斷頸處死后的小鼠，在75%乙醇中浸泡消毒3 min～5 min 后，無菌取出脾臟，利用小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒制備脾淋巴細(xì)胞懸液，以噻唑藍(lán)溴化四唑比色法（MTT 法）測定脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（SI），SI=免疫孔OD570nm均值/陰性對照孔OD570nm均值[12]。

1.9 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+ T 細(xì)胞亞群百分比的測定于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D組和F 組小鼠外周血至抗凝管，每組3 只。取抗凝管中的100 μL 外周血至2 mL 無菌離心管中，加入1.8 mL 紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻后靜置30 min。1 500 r/min 離心5 min，棄上清液。加入1.8 mL 無菌PBS 緩沖液（pH=7.2）反復(fù)吹吸。1 500 r/min 離心10 s，棄去多余液體，保留約200 μL～300 μL 的液體和白細(xì)胞于管底，吹打混勻。設(shè)4 個(gè)陰性對照組，第1 組只加入紅細(xì)胞裂解液，不加熒光抗體染色；另外3 組分別加入CD3+、CD4+和CD8+單一熒光染料。將各組樣品混勻后置4 ℃避光孵育30 min。用無菌PBS 緩沖液（pH=7.2）洗滌孵育后的樣品，2 500 r/min 離心5 min，棄上清液，加入500 μL 無菌PBS 緩沖液（pH=7.2），吹打混勻。將各組細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管。利用流式細(xì)胞儀檢測并分析數(shù)據(jù)[13]。

1.10 各組小鼠的免疫保護(hù)率測定二免7 d 后，將免疫組（A～D）小鼠分別再分為3 組（編號分別為A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3），另設(shè)攻毒對照組（E1～E3）和陰性對照組（F1～F3），每小組5 只。采用腹腔注射的方式對小鼠攻毒，攻毒菌株分別為BZ1（SS2）、BB15-4（SS3）和HBgu18-4（SS4），攻毒劑量分別為5LD100、5LD50和5LD50，陰性對照組注射滅菌生理鹽水。攻毒后，觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、飲食欲及死亡等情況，計(jì)算各組小鼠免疫保護(hù)率。免疫保護(hù)率（%）=[1-免疫組死亡率/對照組死亡率]×100%。

1.11 各組小鼠內(nèi)臟組織荷菌數(shù)的測定在小鼠攻毒3 d、7 d 后，分別無菌采集感染小鼠的肺、肝、脾和腎臟于1.5 mL 離心管中，稱量組織重量，按一定比例加無菌PBS 和磁珠研磨；10 倍倍比稀釋后分別取原液、1∶10、1∶100 3 個(gè)稀釋度的組織懸液1 mL，均勻涂布于TSA-YE 固體培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)法測定不同菌株攻毒后各臟器（肺、肝、脾、腎）中的細(xì)菌菌落數(shù)。

1.12 各組小鼠病理組織學(xué)觀察攻毒7 d 后，采集免疫組、陰性對照組和攻毒對照組小鼠的肺、肝、脾和腎臟，置于10%福爾馬林中，24 h 后重新更換福爾馬林，進(jìn)行固定和保存，制作組織病理切片，觀察各臟器的組織病理學(xué)變化。

1.13 數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)的差異性統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)繪圖均使采用Graphpad.8.0 軟件繪制。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清中IgG 抗體檢測結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，通過間接ELISA 的方法檢測各組小鼠血清中IgG 抗體水平。結(jié)果顯示，首免后14 d 與二免后7 d，A～D 組小鼠的IgG 抗體含量始終保持相同水平，且均顯著高于F 組（P＜0.05）。二免7 d 后，A～D 組的IgG 抗體水平顯著上升（P＜0.05），F(xiàn) 組小鼠的IgG 抗體水平則無顯著變化（P＞0.05）（表2）。表明制備的3 種活菌濃度的SS 三價(jià)滅活苗均可刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體，且與商用疫苗相一致，均為1∶12 800。

表2 SS三價(jià)滅活苗免疫小鼠血清中IgG抗體水平測定結(jié)果Table 2 Determination of IgG antibody level in serum of mice immunized with SS trivalent inactivated vaccine

2.2 各組小鼠的血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果于首免后14 d與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，進(jìn)行血清殺菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示，補(bǔ)體對照組菌落數(shù)為120 cfu。首免14 d 后，A～D 組菌落數(shù)均高于補(bǔ)體對照的50%，對SS 不具有殺滅作用。二免7 d 后，A～D 組菌落數(shù)均顯著降低，且低于補(bǔ)體對照組的50%，對SS具有殺滅作用且各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但與F 組差異顯著（P＜0.05）。二免7 d 與首免14 d 相比，A～D 組菌落數(shù)均顯著減少（P＜0.05），F(xiàn) 組菌落數(shù)始終無顯著變化（P＞0.05）（圖1）。表明制備的3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗免疫小鼠后，血清中的功能性抗體均具有高度殺菌活性，與商用疫苗無顯著差異。

圖1 各組小鼠血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of serum bactericidal test

2.3 各組小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子含量的測定結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清，并按照細(xì)胞因子試劑盒說明書，對各組小鼠血清中的細(xì)胞因子含量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，首免后14 d 與二免后7 d，A～D 組小鼠血清中IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1 含量與F 組相比均有所升高（P＜0.05），且各免疫組間差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。表明制備的3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子，與商用疫苗無顯著差異。

圖2 小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子檢測結(jié)果Fig.2 Levels of detection of relevant cytokines in sera of mice

2.4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠血清并制備脾淋巴細(xì)胞懸液，以MTT 法進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示，首免后14 d 與二免后7 d，A～D 組小鼠脾淋巴細(xì)胞的SI值持續(xù)上升，F(xiàn)組小鼠的SI值始終無顯著變化（P＞0.05）。二免7 d 后，A～D 組小鼠的SI 值持續(xù)上升且顯著高于F 組（P＜0.05）（圖3）。表明制備的3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗均能有效地刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，使其淋巴細(xì)胞不斷活化、增殖和分化，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，且與商用疫苗無顯著差異。

圖3 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Proliferation test results of spleen lymphocytes in mice

2.5 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+ T 細(xì)胞亞群百分比測定結(jié)果于首免后14 d 與二免后7 d，采集A～D 組和F 組小鼠外周血，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T 細(xì)胞亞群含量。結(jié)果顯示，首免14 d 后，A～D 組的CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T細(xì)胞比率均顯著高于F 組（P＜0.05）。二免7 d 后，A～D 組的CD8+/CD3+T 細(xì)胞比率均呈上升趨勢。其中，B組的CD4+/CD3+T細(xì)胞比率顯著高于A、C、D組P＜0.05），但A、C、D 組之間差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。表明制備的3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗均可誘導(dǎo)小鼠T 細(xì)胞亞群比率持續(xù)升高，且B 組的誘導(dǎo)能力強(qiáng)于A、C、D 組。

圖4 小鼠外周血中CD4+、CD8+細(xì)胞亞群在總T細(xì)胞中所占百分比Fig.4 Percentage of CD4+,CD8+subpopulations in peripheral blood of mice in total T cells

2.6 各組小鼠的免疫保護(hù)率測定結(jié)果二免7 d后，均以BZ1、BB15-4 和HBgu18-4 菌株攻毒免疫A～D 組和攻毒對照組（E 組）小鼠，陰性對照組（F組）接種等體積滅菌生理鹽水，每組15 只，觀察7 d，計(jì)算小鼠死亡率。結(jié)果顯示，攻毒7 d 后，E組小鼠均死亡，F(xiàn) 組小鼠均存活，試驗(yàn)成立。在各免疫組中，B、C 組的免疫保護(hù)率均為100%，A、D組的免疫保護(hù)率分別為86.67%和80%（表3）。表明制備的3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗和商用疫苗均能使小鼠產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力。

表3 SS三價(jià)滅活苗對小鼠的免疫保護(hù)率測定結(jié)果Table 3 Immune protection rate of SS trivalent inactivated vaccine in mice

2.7 各組小鼠內(nèi)臟組織荷菌數(shù)檢測結(jié)果在小鼠攻毒3 d、7 d 后，采集不同臟器（肺、肝、脾、腎）測定組織荷菌數(shù)。結(jié)果顯示，攻毒3 d 后，A～D 組小鼠的肺、肝、脾、腎臟組織中均有一定數(shù)量的細(xì)菌定植，且各組間無顯著差異（P＞0.05），而與E 組差異顯著（P＜0.05）；攻毒7 d 后，A～D 組BZ1 菌株菌落數(shù)為0 且與E 組不同組織器官的荷菌數(shù)差異顯著（P＜0.05），A～C 組BB15-4 和HBgu18-4 菌株菌落數(shù)為0 且與D、E 組不同組織器官的荷菌數(shù)差異顯著（P＜0.05），而D、E 組不同組織器官的荷菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05）（圖5）。表明制備的3 種濃度的SS三價(jià)滅活苗均能有效清除SS2、SS3、SS4 在體內(nèi)的定植，商用疫苗能有效清除SS2 在體內(nèi)的定植。

圖5 BZ1、BB15-4、HBgu18-4菌株感染后小鼠各臟器組織中的含菌量Fig.5 BZ1,BB15-4,HBgu18-4 bacterial content of bacteria in various organs of mice after infection

2.8 各組小鼠的組織病理切片觀察結(jié)果于攻毒7 d后取A～F 組小鼠的肺、肝、脾、腎臟制作組織病理切片，觀察組織病理變化。結(jié)果顯示，A1～D1、A2～C2、B3、C3 組肺臟整體結(jié)構(gòu)正常，未見明顯炎性反應(yīng)，D2 組肺間質(zhì)輕微充血，A3、D3 組肺泡壁輕微增厚，但未見明顯炎性細(xì)胞浸潤（圖6）。C1 組肝臟整體結(jié)構(gòu)基本正常，A1、B1、D1組有少量炎性細(xì)胞浸潤，A2～C2、D2 組肝細(xì)胞輕微水腫，A3～C3組肝竇輕微充血擴(kuò)張，未見明顯炎性反應(yīng)，D3 組肝細(xì)胞輕微水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤（圖7）。A1～C1、B2、C2、B3 和C3 組脾臟整體結(jié)構(gòu)正常，D1～D3、A2～A3 組可見少量多核巨細(xì)胞浸潤（圖8）。A1～D1、C2、A3～C3 組腎臟整體結(jié)構(gòu)基本正常，A2、B2 和D2組少量腎小球萎縮，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，D3組腎組織可見少量腎小球萎縮，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤（圖9）。

陰性對照組F 組小鼠各臟器均無明顯病理變化（圖6～圖9）。攻毒對照組E1、E3 組小鼠肺泡壁明顯增厚，E2 組肺泡融合擴(kuò)張形成較大囊泡（圖6）；E1、E2組肝細(xì)胞明顯水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，E3組肝竇間隙明顯增大，明顯炎性細(xì)胞浸潤（圖7）；E1、E2 和E3 組脾組織整體結(jié)構(gòu)異常，紅髓白髓界限不分明，組織可見大量多核巨細(xì)胞浸潤（圖8）；E1 組腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核壞死溶解消失，僅存腎小管輪廓，E2 和E3 組整體結(jié)構(gòu)異常，可見大量腎小管上皮細(xì)胞疏松水腫，少量腎小球明顯萎縮（圖9）。

圖6 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠肺臟組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.6 Histopathological changes of lung in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

圖7 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠肝臟組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.7 Histopathological changes of liver in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

圖8 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠脾臟組織病理學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.8 Histopathological changes of spleen in each group ofmice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

圖9 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各組小鼠腎臟病理組織學(xué)變化（HE染色，200×）Fig.9 Histopathological changes of kidney in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

綜合3 種菌（BZ1、BB15-4、HBgu18-4 株）攻毒后各組小鼠組織（肺、肝、脾、腎臟）病理變化，表明制備的3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗免疫小鼠后，均可刺激機(jī)體產(chǎn)生良好免疫保護(hù)效果，且攻毒后對小鼠肺、肝、脾、腎臟的病理變化的損傷程度均較輕微。

3 討 論

豬鏈球菌病是由SS 引起的以豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎以及敗血癥等臨床癥狀為主要特征的細(xì)菌性傳染病。近年來，隨著全球養(yǎng)殖場集約化、規(guī)?；l(fā)展以及生豬頻繁引種和調(diào)動(dòng)，致使該病的發(fā)病率和致死率明顯升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[14]。抗生素和疫苗接種可用于豬鏈球菌病的防控，但長期不合理的使用抗生素，容易導(dǎo)致SS 耐藥性的產(chǎn)生和耐藥譜的拓寬，疫苗接種儼然成為防控該病的主要措施。但SS 血清型眾多，不同血清型甚至相同血清型不同菌株之間缺乏有效的交叉保護(hù)力，且不同地區(qū)優(yōu)勢菌株分布常處于動(dòng)態(tài)流行中，導(dǎo)致某些豬場雖開展了免疫工作卻未達(dá)到理想的保護(hù)效果。因此，研制出交叉保護(hù)性強(qiáng)的SS 疫苗意義顯著。滅活苗憑借研制周期短，使用安全，易制備多價(jià)、多聯(lián)苗等優(yōu)勢，在臨床上得以普遍應(yīng)用，是生產(chǎn)實(shí)際中防制多種血清型菌株的最優(yōu)選擇。

不同血清型SS 菌株異質(zhì)性明顯，抗原性存在較大差別，因此鑒定與篩選疫苗用優(yōu)勢菌株，對地區(qū)性豬鏈球菌病的防控至關(guān)重要。此外，在疫苗制備的各個(gè)環(huán)節(jié)中，提高疫苗中的有效抗原含量是疫苗免疫效果的關(guān)鍵[15]。不僅如此，滅活條件和佐劑也是影響疫苗免疫效果的主要因素[16]。本實(shí)驗(yàn)室前期對某集團(tuán)公司分布在安徽、江蘇、山東、河北、廣西等5 個(gè)地區(qū)的家庭農(nóng)場，以及安徽地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)豬場（戶）進(jìn)行豬細(xì)菌病流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)主要以SS2、SS3 和SS4 的感染為主。進(jìn)而通過小鼠致病性、抗原性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，綜合篩選得到3 株用于制備疫苗的SS 菌株（HF2、BB15-4 和HBgu18-4株）。本研究在此基礎(chǔ)上，將HF2 和BB15-4 株采用終濃度為0.3%的甲醛37 ℃條件下作用15 h；HBgu18-4 株采用終濃度為0.15%的甲醛37 ℃條件下作用11 h 后滅活，以ISA 201VG 礦物油佐劑配比乳化，制備滅活前分別為1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 種活菌濃度的SS 三價(jià)滅活苗，以昆明鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，采用皮下多點(diǎn)注射途徑與SS商用疫苗同步免疫昆明鼠，進(jìn)行免疫效果評價(jià)。

IgG 抗體是血清中含量最多的抗體，且持續(xù)時(shí)間長，是機(jī)體抗感染免疫的主力，也是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體[17]。但并非所有具有抗原結(jié)合能力的抗體均具有殺菌功能，而通過補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌試驗(yàn)?zāi)軌蛑苯臃从吵隹贵w的功能活性和疫苗的保護(hù)效果[18]。本研究中，A～D 組小鼠的IgG 抗體含量在整個(gè)免疫周期中始終保持相同水平，表明制備的3種濃度的SS 三價(jià)滅活苗與商用疫苗均能產(chǎn)生良好的體液免疫反應(yīng)。血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，A～D 組小鼠免疫后血清中的功能性抗體均具有高度殺菌活性，表明其刺激機(jī)體產(chǎn)生的功能性抗體能夠抵抗細(xì)菌的感染，具有良好的免疫保護(hù)作用。綜合血清殺菌試驗(yàn)和IgG 抗體水平測定結(jié)果表明3 種濃度的SS三價(jià)滅活苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生大量特異性抗體與功能性抗體，可與機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)合殺傷病原菌，與商用疫苗無顯著差異。

脾臟是免疫活性細(xì)胞即T、B 淋巴細(xì)胞定植及發(fā)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的場所[19]。脾淋巴細(xì)胞的增殖能力決定其所產(chǎn)生效應(yīng)淋巴細(xì)胞的數(shù)量和機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的強(qiáng)度。T 淋巴細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞群，可通過CD4+T 淋巴細(xì)胞（Th 細(xì)胞）和CD8+T 淋巴細(xì)胞（Tc 細(xì)胞）亞群釋放大量細(xì)胞因子增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答水平。其中，CD4+T 淋巴細(xì)胞可分為Th1 和Th2 兩個(gè)細(xì)胞亞群，Th1 細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-β 等，可刺激或增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4 和IL-10 等，輔助體液免疫反應(yīng)。MCP-1 作為炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，既能介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，也能促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答[20]。而Tc 細(xì)胞可在Th 細(xì)胞的輔助作用下，發(fā)揮特異性殺傷的功能。因此，細(xì)胞因子水平是機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要反映。本研究中，A～D 免疫組均可刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞大量增殖，在誘導(dǎo)CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞比率持續(xù)升高的同時(shí)還可刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子，表明3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生持久的免疫保護(hù)效果，與商用疫苗無顯著差異。

SS 是一種常見的豬呼吸道細(xì)菌，常定植于扁桃體但不致病。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，SS 可從扁桃體向周圍淋巴組織擴(kuò)散，進(jìn)入血液，進(jìn)而侵襲不同組織器官，引起炎癥反應(yīng)，使機(jī)體相應(yīng)部位形成病灶，造成機(jī)體的損傷或死亡。本研究從攻毒保護(hù)率、組織荷菌數(shù)、組織病理學(xué)方面，進(jìn)一步分析比較了3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗以及商用疫苗的免疫保護(hù)效果。B～C 組的免疫保護(hù)率均為100%，優(yōu)于A組（86.67%）和D 組（80%）。結(jié)合組織荷菌數(shù)分析和病理組織學(xué)變化證實(shí)，與陰性對照組相比，B～C 組的各組織器官的SS 荷菌數(shù)均降低且無顯著差異，但相較于A 組，B～C 組的各組織器官病理變化較輕微或無明顯病理變化。而D 組經(jīng)BB15-4（SS3）和HBgu18-4（SS4）菌株攻毒后，均有一定數(shù)量的SS 定植且病理變化較明顯，這可能與商用疫苗中不包含SS3 和SS4 抗原有關(guān)。說明SS 不同血清型之間缺乏交叉保護(hù)力，多數(shù)血清型菌株只對同源菌株產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，而對異源菌株的免疫保護(hù)力較弱，因而無法切實(shí)有效地保護(hù)實(shí)際生產(chǎn)中SS 優(yōu)勢菌株的感染。因此，在面對SS 多種血清型感染的情況下，選擇使用多價(jià)疫苗來防控豬鏈球菌病顯得尤為重要，這不僅可對當(dāng)前SS 動(dòng)態(tài)流行防制特點(diǎn)提供切實(shí)保護(hù)，也是對目前商用疫苗無法滿足生產(chǎn)實(shí)際需求的有效補(bǔ)充。

綜合上述研究結(jié)果表明，3 種濃度的SS 三價(jià)滅活苗（V-a、V-b、V-c）免疫小鼠后均能產(chǎn)生良好的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中，當(dāng)SS 的濃度分別為2.0×109cfu/mL 和4.0×109cfu/mL（V-b、V-c）時(shí)，疫苗免疫保護(hù)效果最佳，其免疫的小鼠均可有效抵抗SS2、SS3、SS4 強(qiáng)毒株的攻擊，可作為SS 三價(jià)（血清2、3 和4 型）滅活苗的候選疫苗。