牛源肉孢子蟲多重PCR 檢測方法的建立

韓利方，馬超鋒，錢偉鋒，張 旻，位治國，閆文朝*

（1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.信陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽 464000）

肉孢子蟲病是一種食源性人獸共患寄生蟲病，能感染人、哺乳動物和鳥類等多種宿主[1-3]。目前能感染牛的肉孢子蟲主要有5 種，分別為枯氏肉孢子蟲（Sarcocystis cruzi）、毛樣肉孢子蟲（S. hirsuta）、羅氏肉孢子蟲（S. rommeli）、人肉孢子蟲（S. hominis）和黑氏肉孢子蟲（S. heydorni）[4-6]。黃牛、奶牛和野牛等?？苿游锸沁@5 種肉孢子蟲的中間宿主，犬科動物或貓科動物或靈長類為終末宿主[4,6-7]?？菔先怄咦酉x是牛群中的優(yōu)勢蟲種，并且對牛致病性最強(qiáng)，該蟲種可寄生于牛橫紋肌、心肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起發(fā)熱、貧血、嗜酸性粒細(xì)胞肌炎、流產(chǎn)、神經(jīng)癥狀和死亡等癥狀和病變[4,8]。人肉孢子蟲和黑氏肉孢子蟲還可引起人牛的感染和發(fā)病，具有重要的公共衛(wèi)生意義[3,6]。其他蟲種對牛也表現(xiàn)不同程度的致病性[4]。

牛肉是國人常見的肉食品，保證牛肉的衛(wèi)生安全非常重要。常規(guī)的肌肉壓片鏡檢不能區(qū)分5 種牛源肉孢子蟲[8-9]。多重PCR 具有靈敏、特異和便捷等特點(diǎn)[10-11]，因此本研究基于各肉孢子蟲的18S rDNA或COX1 序列，建立了多重PCR 方法，能快速檢測樣品中5 種牛源肉孢子蟲，為牛和人肉孢子蟲病診斷和分子流行病學(xué)研究提供更有效的分子檢測工具。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料2×EasyTaq?PCR SuperMix、DL2000 Plus DNA Marker、EasyPure?Quick Gel Extraction Kit、pEASY-T1 克隆載體、EasyPure?Plasmid MiniPrep Kit 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；從洛陽地區(qū)超市和冷鮮肉專賣店購買新鮮牛肉，經(jīng)肌肉壓片鏡檢和18S rDNA 分子鑒定為枯氏肉孢子蟲、毛樣肉孢子蟲、羅氏肉孢子蟲和黑氏肉孢子蟲包囊陽性樣品，組織勻漿后，用細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒提取上述4 種肉孢子蟲陽性的牛肉樣品、米氏肉孢子蟲陽性的豬肉樣品、剛地弓形蟲和犬新孢子蟲速殖子基因組DNA。這些肉樣和不同蟲種基因組DNA 于-20 ℃保存于河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院寄生蟲學(xué)實驗室。

1.2 引物設(shè)計與合成參照GenBank 中毛樣肉孢子蟲（KT901163）、黑氏肉孢子蟲（KX057997）、人肉孢子蟲（KF954731）的18S rDNA 序列和枯氏肉孢子蟲（KC209598）、羅氏肉孢子蟲（KY120291）的COX1 序列，利用DNAStar-MegAlign 軟件序列比對后，參照文獻(xiàn)[12-13]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成相關(guān)序列各蟲種特異區(qū)引物（表1）。

1.3 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備與鑒定以枯氏肉孢子蟲、黑氏肉孢子蟲、羅氏肉孢子蟲和毛樣肉孢子蟲陽性肉樣的基因組DNA為模板，采用肉孢子蟲屬通用引物擴(kuò)增18S rDNA 序列（SAR18SF：5′-GCTCTGAG ATGAAAGTCTAG-3′，SAR18SR：5′-TCCTTCCGCCGT ATTATC-3′）或COX1 序列（SARCOX1F：5′-GGTATCT TTAGCGTTGTTGGT-3′，SARCOX1R：5′-GCCGAAT TACGAATGATATGGC-3′），并克隆至pEASY-T1 載體中，通過菌落PCR 和測序鑒定獲得重組質(zhì)粒pEASY-T1-Shir18S rDNA、pEASY-T1-Shey18S rDNA、pEASY-T1-ScruCOX1、pEASY-T1-SromCOX1；根據(jù)GenBank 中人肉孢子蟲18S rDNA 序列（KF954731），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成人肉孢子蟲18S rDNA 序列，并克隆至pEASY-T1 載體中，通過菌落PCR 和測序鑒定獲得重組質(zhì)粒pEASY-T1-Shom18S rDNA。用分光光度計測定和計算這5 種重組質(zhì)粒的濃度（ng/μL），計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)，將5 種質(zhì)粒濃度均調(diào)整為6×109拷貝/μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒用于后續(xù)試驗[10,12]。

1.4 單一PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，采用25 μL 反應(yīng)體系，以5 種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為DNA模板，分別以每種肉孢子蟲的單對引物進(jìn)行單一PCR 擴(kuò)增，引物濃度設(shè)置為2.0 μmol/L、1.5 μmol/L、1.0 μmol/L、0.5 μmol/L。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃5 min，94 ℃40 s、51 ℃～59 ℃30 s、72 ℃60 s，共35 個循環(huán)，72 ℃10 min。采用方陣法優(yōu)化枯氏肉孢子蟲、人肉孢子蟲、黑氏肉孢子蟲、羅氏肉孢子蟲和毛樣肉孢子蟲PCR 最佳引物濃度和退火溫度。

1.5 多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化參考1.4 中單一PCR 最佳引物濃度，將牛源肉孢子蟲的5 對引物混合后進(jìn)行PCR 檢測，確定引物間無干擾后，將5 種肉孢子蟲的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等體積混合后（終濃度均為6×104拷貝/μL）作為模板，退火溫度設(shè)置為51 ℃～59 ℃，其他條件參照1.4， 采用方陣法優(yōu)化最佳多重PCR 退火溫度。

1.6 多重PCR 方法的特異性試驗采用優(yōu)化后的多重PCR 反應(yīng)條件，以剛地弓形蟲和犬新孢子蟲速殖子基因組DNA、米氏肉孢子蟲、枯氏肉孢子蟲、毛樣肉孢子蟲、羅氏肉孢子蟲和黑氏肉孢子蟲包囊基因組DNA、人肉孢子蟲重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以評價多重PCR方法的特異性[10-12]。

1.7 多重PCR 方法的敏感性試驗采用優(yōu)化后的多重PCR 和單一PCR 反應(yīng)條件，分別以10 倍倍比稀釋的5 種牛源肉孢子蟲重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物（0.6拷貝/μL～6×104拷貝/μL）為模板，進(jìn)行多重PCR 和單一PCR 擴(kuò)增，評價多重PCR 方法的敏感性[10-12]。

1.8 臨床樣品的檢測選取34 份牛肉樣品，每份樣品采集3 g～5 g 肉樣勻漿，再利用細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒提取組織總DNA，采用本研究建立的多重PCR 方法對提取的基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。同時采用肌肉壓片鏡檢方法檢測這些臨床樣品肉孢子蟲，比較二者的檢測結(jié)果，并計算二者的符合率[12]。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果經(jīng)菌落PCR鑒定和測序分析結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEASY-T1-Shir18SrDNA、pEASY-T1-Shom18SrDNA、pEASY-T1-Shey18S rDNA、pEASY-T1-ScruCOX1、pEASY-T1-SromCOX1均正確構(gòu)建。利用Nanodrop 2000 測定質(zhì)粒的濃度再根據(jù)公式計算重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示pEASY-T1-Shir18SrDNA為3.55×1010拷貝/μL；pEASYT1-Shom18SrDNA 為4.78×1010拷貝/μL；pEASY-T1-Shey18SrDNA 為3.99×1010拷貝/μL；pEASY-T1-Scru-COX1 為3.52×1010拷貝/μL；pEASY-T1-SromCOX1 為5.01×1010拷貝/μL。將5 種重組質(zhì)粒均調(diào)整至6.0×109拷貝/μL，作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，用于后續(xù)PCR 擴(kuò)增的陽性模板。

2.2 單一PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果經(jīng)過單一PCR 優(yōu)化結(jié)果顯示，反應(yīng)體系為25 μL，利用設(shè)計的引物（表1）均可擴(kuò)增出目的條帶，5 種牛源肉孢子蟲特異有效的引物濃度均為0.5 μmol/L，即每管加入1 μL 12.5 μmol/L 的上、下游引物。5 種牛源肉孢子蟲引物的最佳退火溫度是54 ℃～58 ℃，循環(huán)中的延伸時間是40 s～60 s。

表1 牛源肉孢子蟲多重PCR的檢測引物Table 1 Primers used in the Multiplex PCR for the detection of the Sarcocystis species

2.3 多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果多重PCR 優(yōu)化結(jié)果顯示，反應(yīng)體系為25 μL，最佳引物工作濃度均為0.5 μmol/L，即每管加入1 μL 12.5 μmol/L 的上、下游引物，各引物混合后擴(kuò)增無引物二聚體，無相互干擾。最佳PCR 擴(kuò)增條件為94 ℃5 min，94 ℃40 s、56 ℃40 s、72 ℃60 s，共35個循環(huán)，72 ℃10 min。利用優(yōu)化后的退火溫度和引物濃度等參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果顯示，5 種PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小均與預(yù)期一致，羅氏肉孢子蟲引物（CROMF/R）擴(kuò)增長度為287 bp；枯氏肉孢子蟲引物（CCRUF/R）擴(kuò)增長度為400 bp；人肉孢子蟲引物（CHOMF/R）擴(kuò)增長度為530 bp；毛樣肉孢子蟲引物（CHIRF/R）擴(kuò)增長度為1 007 bp；黑氏肉孢子蟲引物（CHEYF/R）擴(kuò)增長度為643 bp，片段大小差別明顯，易于區(qū)分（圖1）。

圖1 牛源肉孢子蟲多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The amplification results of the Multiplex PCR for detecting the Sarcocystis species

2.4 多重PCR 的特異性試驗結(jié)果特異性試驗結(jié)果顯示，本研究建立的多重PCR 方法對米氏肉孢子蟲、剛地弓形蟲、犬新孢子蟲基因組等樣品均未擴(kuò)增出目的條帶，而枯氏肉孢子蟲、毛樣肉孢子蟲、羅氏肉孢子蟲和黑氏肉孢子蟲包囊基因組DNA、人肉孢子蟲的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶（圖2），表明本實驗建立的多重PCR 具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 牛源肉孢子蟲多重PCR特異性試驗結(jié)果Fig.2 The specificity of the Multiplex PCR for detecting the Sarcocystis species

2.5 多重PCR 的敏感性試驗結(jié)果敏感性試驗結(jié)果顯示，多重PCR 對5 種牛源肉孢子蟲重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限為6 拷貝/μL（圖3）。5 種單一PCR 的最低檢測限也為6 拷貝/μL，與多重PCR 基本一致（圖略）。表明本實驗建立的多重PCR 具有較高的敏感性。

圖3 牛源肉孢子蟲多重PCR敏感性試驗結(jié)果Fig.3 The sensitivity of the Multiplex PCR for detecting the Sarcocystis species

2.6 臨床樣品的檢測結(jié)果該多重PCR 方法對34份牛肉樣品的檢測結(jié)果顯示，有6 份樣品為枯氏肉孢子蟲陽性，3 份毛樣肉孢子蟲，2 份羅氏肉孢子蟲，未檢出人肉孢子蟲和黑氏肉孢子蟲。肌肉壓片鏡檢結(jié)果顯示，有9 份樣品為肉孢子蟲包囊陽性，無法鑒定到種。經(jīng)計算，本研究建立的多重PCR 檢測結(jié)果與肌肉壓片鏡檢陽性符合率為100%，陰性符合率為92%，總體符合率為94.1%（表2）。表明該研究建立的多重PCR 比肌肉壓片鏡檢具有更高的敏感性，可用于臨床樣品檢測。

表2 臨床樣品的檢測結(jié)果Table 2 Comparison of the Multiplex PCR with the microscopic observation of squashing slides

3 討 論

肉孢子蟲在牛群中有較高的感染率[13-15]。目前5種牛源肉孢子蟲的生活史均研究清楚，這5 種肉孢子蟲的中間宿主均是奶牛、肉牛和野牛等?？苿游?。牛食入肉孢子蟲卵囊或孢子囊后，裂殖生殖階段的蟲體可存在于牛的全身各臟器的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)和血液內(nèi)，包囊寄生于橫紋肌、心肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[6-7,16]?？菔先怄咦酉x對牛的致病性最強(qiáng)，食入20 萬個孢子囊，即可引起牛發(fā)熱、癱瘓、流產(chǎn)和死亡[17]。感染有黑氏肉孢子蟲和人肉孢子蟲包囊的牛肉被人食入后，在人的小腸進(jìn)行配子生殖和孢子生殖，引起嘔吐、腹瀉等癥狀，隨人的糞便排出卵囊或孢子囊[6]。因此，可以通過檢測牛的血液、臟器、肌肉、腦組織和人、犬、貓等終末宿主的糞便等樣品中肉孢子蟲不同階段蟲體，為防控牛和人的肉孢子蟲病提供重要依據(jù)。

肉孢子蟲常用的檢測方法是肌肉壓片鏡檢法，但是顯微鏡下不能辨別不同蟲種，而且牛肉中的肌間脂肪等組織與肉孢子蟲包囊形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，容易混淆[9]。ELISA 抗體檢測試劑盒只能檢測肉孢子蟲抗體，也不能區(qū)分不同蟲種[8]。PCR 技術(shù)可以實現(xiàn)對病原基因組DNA 進(jìn)行指數(shù)級快速擴(kuò)增，具有敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)[15-16]?；诙鄬σ锏亩嘀豍CR 技術(shù)可以實現(xiàn)同時對同一份樣品中多種病原或同種病原不同亞型的鑒別檢測，具有簡便、快速的優(yōu)點(diǎn)[10-12]。本研究利用5 種牛源肉孢子蟲的18S rDNA 或COX1 序列種特異引物，建立牛源肉孢子蟲多重PCR鑒別檢測方法，通過一次PCR 檢測就能準(zhǔn)確區(qū)分枯氏肉孢子蟲、毛樣肉孢子蟲、羅氏肉孢子蟲、黑氏肉孢子蟲和人肉孢子蟲。除了牛肉樣品外，推測該多重PCR方法還可以用于牛的血液、臟器和犬、貓、人等終末宿主糞便樣品中肉孢子蟲的鑒定，這有待于進(jìn)一步試驗。

本研究用到的枯氏肉孢子蟲、毛樣肉孢子蟲、羅氏肉孢子蟲和黑氏肉孢子蟲的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中的目的基因18S rDNA 或COX1序列均來源于本實驗前期分離的肉孢子蟲包囊陽性樣品。另外，由于本實驗沒有分離到人肉孢子蟲樣品，參考GenBank 里人肉孢子蟲18S rDNA 序列，委托生物公司合成了1 849 bp 的18S rDNA序列，然后克隆至pEASY-T1克隆載體中，得到重組質(zhì)粒pEASY-T1-Shom18SrDNA，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)對照樣品。與直接來源于肉孢子蟲包囊或孢子囊的基因組DNA 相比，5 種牛源肉孢子蟲的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可以體外重復(fù)批量化生產(chǎn)，對將來組裝商品化牛源肉孢子蟲多重PCR 檢測試劑盒來說具有更高的可行性[12]。總之，本研究首次建立的5 種牛源肉孢子蟲多重PCR鑒別檢測方法可以用于檢測牛肉等相關(guān)樣品中肉孢子蟲的感染情況，為牛和人肉孢子蟲病診斷和分子流行病學(xué)研究提供重要的分子檢測工具。