犬細小病毒黑龍江流行株的分離鑒定及其VP2 基因的遺傳進化分析

高 艷，張 峣，都興洋，蔣烈戈，涂亞斌，張興山，韓 雪，高宏雷1,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069；2.哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150069；3.廣東省黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東 東莞 523000；4.新疆兵團第九師畜牧科學(xué)研究所，新疆 額敏 834601；5.哈爾濱市寵興動物醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）是一種能引起犬急性出血性腸炎和非化膿性心肌炎為主要特征的高度傳染性和致死性病原，也是2 月齡～6 月齡幼犬消化道疾病的主要病原之一[1]。該病毒于1978年首次從澳大利亞患腸炎的病犬中分離到[2]，之后其在世界范圍內(nèi)被陸續(xù)報道。CPV 通常與犬瘟熱病毒、犬腺病毒及犬冠狀病毒混合感染，嚴重危害我國養(yǎng)犬業(yè)及寵物行業(yè)的健康發(fā)展。CPV 所致疫病一年四季均可發(fā)生，以發(fā)病急、病程短、傳染性強為主要特征[3]。

CPV 屬于細小病毒科細小病毒屬，病毒粒子無囊膜，呈二十面體結(jié)構(gòu)，直徑為20 nm～24 nm，基因組全長約為5 kb[4]，包含兩個主要的開放式閱讀框（ORF），分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2），其中VP2 是最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒衣殼的90%，也是決定病毒抗原性和病毒與宿主相互作用的主要蛋白[5]。VP2 蛋白氨基酸位點的變化對細小病毒的宿主范圍有重要影響[6-7]。在該病毒的進化過程中，由于關(guān)鍵氨基酸位點的突變，CPV-2 逐漸分化出CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c 亞型[8-9]。

為了研究當前黑龍江省CPV 流行株的變異情況，本研究從經(jīng)CPV 膠體金試紙鑒定為CPV 陽性的病犬糞便中分離出8 株CPV，對其進行了血凝性和基因分型等鑒定，對8 株分離病毒的VP2 基因做了測序及遺傳進化分析，并對其中4 株病毒做了犬的回歸試驗和2 株強毒株的鑒定試驗，以期為該地區(qū)的犬細小病毒病的防制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病料樣品、病毒株及細胞系有臨床腹瀉癥狀病犬的10 份糞便樣品，分別來自黑龍江省哈爾濱市、雙城市、鶴崗市和大慶市動物醫(yī)院的患病犬，經(jīng)膠體金試紙條檢測呈CPV 陽性；CPV YNR 株和貓腎細胞（F81）均由本實驗室保存。

1.2 實驗動物及主要試劑1 月齡～3 月齡雜交幼犬（經(jīng)檢測CPV 中和抗體效價≤1∶2），購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物醫(yī)學(xué)部。胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自Gibco 公司；東洋紡高保真Taq酶；限制性內(nèi)切酶及DNA 提取試劑盒均購自TaKaRa 公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank 登錄的CPV全基因組（KR002805.1）VP2 基因保守序列，利用Premier 6.0 軟件設(shè)計2 對引物，其中一對引物用于擴增CPV VP2 全基因，預(yù)期擴增片段長度為2 000 bp，引物序列為V1：5′-CATCCATCAACATCAAGACCAA C-3′/V2：5-TGTATACCATATAACAAACCTTC-3′；另一對引物P1/P2 用于分離CPV 的PCR 鑒定及病毒的分型鑒定，預(yù)期擴增片段長度為297 bp，引物序列為P1：5′-CAGGAAGATATCCAGAAGGA-3′/P2：5′-GGTGCTAGTTGATATGTAATAAACA-3′，引物均由哈爾濱睿博興科生物公司合成。

1.4 病毒的分離和培養(yǎng)取1 g～2 g 糞便樣品，用600 μL無菌PBS 溶解稀釋，再加3 倍體積的無菌PBS混勻，經(jīng)1 000 r/min 離心8 min，上清用0.22 μm 無菌濾器過濾除菌并3 倍稀釋后，按照10%比例接種F81 細胞懸液，同時設(shè)正常細胞對照，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變（CPE）情況，盲傳5 代，如果出現(xiàn)CPE 則收獲細胞培養(yǎng)物均置-80 ℃保存，如傳到第5 代仍無CPE 則將樣品視為陰性。

1.5 分離病毒的鑒定

1.5.1 分離病毒的TCID50及HA 效價的測定 取糞便樣品的第5代細胞與上清的混合培養(yǎng)物，10倍倍比稀釋后，接種96 孔板中的F81 細胞懸液，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，逐日觀察CPE，按Reed-Muench法計算分離病毒的TCID50；同時采用微量血凝試驗鑒定分離病毒的血凝性[10]。

1.5.2 分離病毒血清型的PCR 鑒定 將第5 代F81細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3 次，提取樣品中的總DNA，利用引物P1/P2 經(jīng)PCR 鑒定。設(shè)本實驗室保存的CPV YNR株為陽性對照，細胞培養(yǎng)液樣品為陰性對照。PCR產(chǎn)物由哈爾濱睿博興科生物公司測序，分析aa426 和aa440 的氨基酸類型，以確定病毒的基因分型。

1.5.3 分離病毒VP2基因的遺傳進化分析 分別以分離病毒提取的總DNA 為模板，利用引物V1/V2 通過PCR 擴增VP2 基因，PCR 擴增條件為：95 ℃30 s；95 ℃30 s；52 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃10 min，PCR 產(chǎn)物由哈爾濱睿博興科生物公司測序。測序結(jié)果拼接后利用MEGAX64 軟件與Gen-Bank 已登錄的CPV 參考株進行比對分析。

1.6 分離病毒的動物回歸試驗選取14 只未免疫CPV 疫苗的1 月齡～3 月齡雜交幼犬，利用病毒中和試驗方法檢測幼犬的CPV 母源抗體[11]，當幼犬體內(nèi)CPV 的中和抗體效價≤1∶2 即可用于后續(xù)試驗。將14只幼犬分為1～4 組，3 只/組和對照組（2 只）。選取致細胞產(chǎn)生嚴重CPE 的1 株分離病毒和血凝效價較高的3 株分離病毒，1～4 組幼犬分別經(jīng)口服該4 株CPV 的第5 代細胞培養(yǎng)物、同時經(jīng)大腿內(nèi)側(cè)肌肉分3點注射病毒，使病毒的感染劑量達104.5TCID50/犬；對照組2 只幼犬采用相同的方式口服和注射相同劑量的細胞培養(yǎng)液。對照犬和實驗犬隔離飼養(yǎng)，每天觀察各犬的臨床癥狀、測量體溫。于感染后第7 d采肛門拭子，拭子經(jīng)常規(guī)處理后提取上清液中的病毒總DNA 并作為模板，利用引物P1/P2 經(jīng)PCR 檢測犬的排毒情況；根據(jù)發(fā)病犬臨床癥狀的嚴重程度確定剖殺各組犬的時間，取其心、肝臟、脾臟、肺臟、腸淋巴結(jié)及十二指腸和空腸病料樣品，研磨、離心處理后取上清提取各臟器樣品的總DNA 并作為模板，利用P1/P2 引物經(jīng)PCR 檢測CPV 在各臟器的分布情況。設(shè)本實驗室保存的CPV 為陽性對照，細胞培養(yǎng)液為陰性對照。

1.7 分離病毒的強毒鑒定試驗按照1.6 的方法監(jiān)測幼犬體內(nèi)CPV 的母源抗體，當其體內(nèi)CPV 的中和抗體效價≤1∶2 即可用于后續(xù)試驗。將8 只幼犬分為實驗A 組（3 只）、實驗B 組（3 只）和對照組（2 只），選擇動物回歸試驗中致犬臨床癥狀較典型的2 號犬（感染CX-3 株CPV）和5 號犬（感染CX-5 株CPV）的組織病料樣品進行強毒鑒定試驗：分別將2 號犬和5 號犬的十二指腸和空腸病料樣品研磨混合后離心取上清液，5 mL/犬經(jīng)口服方式分別感染A 組和B 組犬，對照2 只犬采用相同的方式口服細胞培養(yǎng)液，5 mL/犬。將對照犬和實驗犬隔離飼養(yǎng)，每天觀察各犬的臨床癥狀、測量體溫。并于感染后第7 d 采肛門拭子，采用1.6 的PCR 方法檢測犬的排毒情況及CPV 在各組犬各臟器的分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離和培養(yǎng)10 份病料樣品接種F81 細胞后，有兩份病料樣品接種后的細胞均不貼壁且均破碎死亡，另外8 份病料樣品分別在傳到第2～5 代時，細胞出現(xiàn)不同程度的CPE，多數(shù)細胞在接種后72 h 左右開始出現(xiàn)腫脹、圓縮、凝聚成團，并呈拉網(wǎng)狀等（圖1），符合CPV 病變特征，初步表明分離到8 株CPV，分別命名為CPV-CX-1（簡寫為CX-1，其余病毒名稱同樣簡寫）～CX-3、CX-5～CX-8、CX-10。

圖1 CPV分離株在F81細胞中產(chǎn)生的CPEFig.1 Cytopathic effect induced by canine parvovirus isolates in F81 cells

2.2 CPV 的TCID50及HA 效價的測定結(jié)果分別取分離病毒的第5 代培養(yǎng)物， 10 倍倍比稀釋后接種細胞，按Reed-Muench 法計算TCID50，結(jié)果顯示不同分離株在F81 細胞中的增殖也不相同，其中CX-5、CX-10 效價均可達到105.67TCID50/mL（表1）；采用微量血凝試驗，在96 孔V型板上測定分離的8 株CPV的血凝效價，結(jié)果只有CX-1、CX-5、CX-7、CX-10 有不同程度的血凝性（表1）。表明分離到的CPV在F81 細胞中的增殖能力存在差異，其中CX-5、CX-10 在F81 細胞中的增殖能力更強，且8 株分離病毒的血凝性也不一致。

表1 分離CPV的TCID50及HA效價測定結(jié)果Table 1 Virus load and hemagglutination assay results

2.3 CPV 的PCR 及基因分型鑒定結(jié)果分別將8株分離病毒的第5 代細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3 次后，提取總DNA 作為模板，經(jīng)PCR 鑒定。結(jié)果顯示，8株分離病毒均在297 bp 處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。進一步表明分離到了8 株CPV。依據(jù)aa426 和aa440 分別為N、A 的為2a 型；aa426 和aa440 分別為D、A 的為2b 型；aa426 和aa440 分別為E、T 的為2c 型。擴增的片段經(jīng)測序并分析后的結(jié)果顯示，CX-1、CX-5、CX-7、CX-10 均為2a 型，CX-6 為2b 型，其余均為2c 型。

圖2 分離病毒的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR amplified products from the virus

2.4 CPV VP2 基因的遺傳進化分析將分離的8 株病毒與5 株CPV 參考株的VP2 基因利用MEGAX64 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，分離的8 株CPV 分為兩大分支，其中CX-2、CX-3 株與CX-8 株處于一大分支，親緣關(guān)系較近，CX-1、CX-7 株與CX-5、CX-6、CX-10 株處于另一大分支，親緣關(guān)系也較近；其中CX-8 株與澳大利亞株、日本分離株、四川分離株、北京及吉林延吉分離株的親緣關(guān)系相對較近； CX-1、CX-5、CX-6、CX-7、CX-10 株均與參考株親緣關(guān)系較遠，其中CX-1 和CX-7 株親緣關(guān)系最近，處于同一分支（圖3）。結(jié)果表明，黑龍江省流行的CPV 與以往國內(nèi)外參考株的親緣關(guān)系相對較遠，且黑龍江省不同地區(qū)CPV的流行呈多樣性。

圖3 CPV VP2基因的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the VP2 genes of CPV

2.5 動物回歸試驗結(jié)果實驗犬分別口服和肌注CX-3、CX-5、CX-7、CX-10 株的第5 代細胞培養(yǎng)物，感染CX-5 株的犬在感染后第5 d 分別出現(xiàn)精神沉郁、采食下降的癥狀，感染后第6 d 有2 只犬體溫升高至39.5 ℃和39.6 ℃，3 只犬均出現(xiàn)血便，有腥臭味，其中一只犬在感染后第7 d 出現(xiàn)水樣稀便；感染CX-3 株的犬分別于感染后第7 d～9 d 出現(xiàn)精神沉郁，其中一只犬體溫最高至39.3 ℃；另外兩組組實驗犬均有精神沉郁，采食下降的癥狀，且體溫均有一過性升高；對照犬均正常，無任何臨床癥狀。感染后第10 d 迫殺全部犬，采集其心、肝臟、脾臟、肺臟、腸淋巴及十二指腸和空腸，以研磨處理的各臟器樣品及感染后第7 d 犬肛門拭子的處理液為模板，提取病毒總DNA，利用P1/P2 引物經(jīng)PCR檢測CPV。結(jié)果顯示實驗犬各臟器及肛門拭子樣品均能擴增出目的條帶，而陰性對照犬的各臟器和肛門拭子均為陰性結(jié)果（圖4）。表明分離的CX-3 和CX-5 兩株病毒比CX-7 和CX-10 的毒力更強，致犬的臨床癥狀更明顯。

圖4 感染犬各臟器（A）及肛門拭子（B）樣品的PCR檢測結(jié)果Fig.4 PCR results of CPV from organs(A)and anal swabs(B)of infected dogs

2.6 CPV強毒的鑒定結(jié)果實驗組犬分別口服CX-3（實驗A 組犬）和CX-5（實驗B 組犬）感染犬的十二指腸和空腸病料樣品研磨后混合處理懸液后，兩組犬分別在感染后第5 d～第7 d 體溫升高，A 組犬體溫最高至39.7 ℃，B 組犬體溫最高至39.8 ℃，A 組有2 只犬在感染后第6 d 有嘔吐現(xiàn)象，第7 d 出現(xiàn)腹瀉癥狀，排水樣稀便，第8 d 有一只犬食欲廢絕；B 組犬于感染后第6 d～第7 d 食欲廢絕，第8 d 出現(xiàn)輕度血便、脫水癥狀，第9 d 均出現(xiàn)CPV 感染的典型癥狀：醬油色稀便，對照犬均正常，無任何臨床癥狀。感染后第10 d 迫殺全部犬，采集其心、肝臟、脾臟、肺臟、腸淋巴結(jié)及十二指腸和空腸，以研磨處理的各臟器樣品及犬肛門拭子處理液為模板，提取病毒總DNA，利用P1/P2 引物經(jīng)PCR 檢測CPV，結(jié)果顯示感染犬樣品均能擴增出297 bp的目的片段，對照犬均為陰性結(jié)果（圖5）。表明分離到了兩株CPV 強毒。

圖5 感染犬各臟器（A）及糞便排毒（B）的檢測結(jié)果Fig.5 Results of CPV replication in various organs(A)and virus shedding in feces(B)in infected dogs

3 討 論

到目前為止，世界范圍內(nèi)CPV 的流行株還是以2a 型和2b 型為主，2c 型也在部分國家流行[12]。CPV是一種在復(fù)制過程中要依賴宿主細胞的單鏈DNA 病毒，其在復(fù)制過程中的復(fù)制效率和糾錯能力不強，因此該病毒基因組的突變率高于一般的DNA 病毒，也導(dǎo)致CPV 對環(huán)境和宿主的適應(yīng)性及逃避宿主免疫應(yīng)答的能力大幅提高，從而提高了CPV 的進化效率和其在宿主動物體內(nèi)的傳播能力[13]。CPV 的這種進化速度快，且不斷出現(xiàn)新血清型的特性，給迅速發(fā)展的養(yǎng)犬業(yè)疾病的防控帶來很大的難度[14]。

本研究從黑龍江不同地區(qū)的患病犬糞便中分離出8 株CPV，對其的分型鑒定結(jié)果顯示， 1 株病毒為2b 型（占比為12.5%），3 株病毒為2c 型（占比為37.5%），其余4 株均為2a 型（占比為50%）。王洋、胡博等于2018 年通過對CPV BJ03/17 株及國內(nèi)外最近流行株的比較發(fā)現(xiàn)，與近幾年分離株BJ15-1、SD19、LN1、SH1 及最新分離株SH15 相比，CPVBJ03/17 株VP2 主要的氨基酸位點并未發(fā)生變化，說明國內(nèi)部分地區(qū)的CPV 流行株大體一致，且主要為2a 亞型，其次為2b 亞型[4]。孫明、鄧小雨等于2017 年報道，我國流行的CPV 以2a 亞型為主，2b 伴隨存在，2c 偶爾存在[15]。張淮瑜等于2020 年的研究結(jié)果顯示，new CPV-2a 和new CPV-2b 似乎分別取代了原2a 和2b 亞型，成為許多亞洲國家主要流行的亞型，而2c亞型則在許多歐洲和美洲國家占主導(dǎo)地位[1]，然而本研究結(jié)果顯示，黑龍江地區(qū)流行的CPV 以2c 亞型較多，但仍以2a 亞型為主，說明近年來亞洲國家CPV 的流行已不僅是2a 和2b 亞型， 2c 亞型的流行有上升的趨勢。另外在對CPV VP2 完整基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，相對而言，分離的8 株CPV 與澳大利亞、日本及國內(nèi)部分地區(qū)CPV 參考株的親緣關(guān)系較遠，僅CX-8 株與參考株親緣關(guān)系較近，且8 株CPV分為兩大分支，其中CX-2、CX-3 株與CX-8 株處于一大分支，親緣關(guān)系較近，CX-1、CX-7 株與CX-5、CX-6、CX-10 株處于另一大分支，親緣關(guān)系也較近，說明黑龍江省流行的CPV與以往國內(nèi)外參考株的親緣關(guān)系相對較遠，且黑龍江省不同地區(qū)CPV 的流行呈多樣性，另外由于CPV VP2 蛋白的氨基酸序列存在多種變異，因此，對更多地區(qū)CPV 抗原變異株的分子監(jiān)測顯得尤為重要[16]。

在動物回歸試驗中選取了HA 效價較高的3 株病毒和致嚴重CPE 的1 株病毒進行動物感染試驗，結(jié)果感染犬均不同程度發(fā)病，根據(jù)該試驗結(jié)果選取了2 株毒力較強的CPV，再次感染幼犬進行了強毒鑒定試驗，結(jié)果這2 株病毒感染的幼犬均出現(xiàn)了CPV的典型發(fā)病癥狀，且CPV 在感染犬的各臟器均能夠復(fù)制，組織嗜性較廣，且能夠通過糞便排毒，表明這2 株均為CPV 強毒。目前，CPV 在臨床大多伴有犬瘟熱病毒（CDV）和或犬腺病毒（CAV）的混合感染，所以臨床犬的發(fā)病癥狀不僅是CPV 的單獨感染所致，因此，實驗室僅以CPV 感染幼犬尤其是雜交犬，很少能出現(xiàn)較典型的臨床癥狀，更少有致感染犬死亡的，本研究中分離到的強毒株感染雜交幼犬后能產(chǎn)生典型CPV 感染的臨床癥狀，說明分離到的這兩株CPV 強毒，可以用于后續(xù)強毒模型的建立試驗。本研究為黑龍江省CPV 的流行病學(xué)調(diào)查和其遺傳進化等研究提供數(shù)據(jù)支持，同時也為后續(xù)的疫苗研究及強毒模型的建立奠定基礎(chǔ)。