H4N6 亞型禽流感病毒的進(jìn)化和生物學(xué)特性分析

莊藝超，孟 飛，鄧國華，施建忠，張亞萍，趙聰慧，陳化蘭

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科，A 型流感病毒屬，其基因組包括8 個基因節(jié)段，為一種單股負(fù)鏈RNA 病毒[1]。根據(jù)病毒的兩種表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性不同，可將AIV 劃分為16 種HA 亞型和9 種NA 亞型。此外，還有在自然界中的蝙蝠體內(nèi)分離到H17N10和H18N11兩種新型流感病毒[2-3]。根據(jù)AIV對禽類致病性的差異，又可將其分為高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV）兩類。目前，除了絕大部分H5 亞型和部分H7 亞型AIV 屬于HPAIV之外，其余病毒均為LPAIV。

自1956 年，H4 亞型AIV（A/duck/Czech Republic/1/1956（H4N6））在捷克斯洛伐克的家鴨中首次成功被分離后，在過去的幾十年間，H4 亞型AIV 已經(jīng)在亞洲、北美、歐洲等地廣泛流行，并在野鳥、家禽以及豬等哺乳動物體內(nèi)監(jiān)測到[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，Bui等在日本北海道北部，已分離到不經(jīng)過提前適應(yīng)即可在小鼠體內(nèi)有效復(fù)制的H4N8 亞型AIV，并可引起小鼠嚴(yán)重呼吸道疾病甚至死亡[6]。加拿大和中國也曾報道了3 例H4 亞型AIV 感染豬的病例[5,7-8]。此外，越來越多的血清學(xué)研究也顯示，在中國、美國和黎巴嫩的家禽養(yǎng)殖場工人血清中檢測出針對H4亞型AIV 的特異性抗體[8-9]。上述報道表明，H4 亞型AIV 不但在禽鳥中廣泛存在，還可以感染哺乳動物和人類，因此具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

目前，H4 亞型AIV 在我國分布廣泛，在大部分的活禽市場和個別水禽養(yǎng)殖場均有可能監(jiān)測到該類病毒，但由于其對家禽呈現(xiàn)低致病力往往被人們忽視。Liang 等對2009 年～2012 年在中國活禽市場分離到的H4 亞型AIV 進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)我國存在多種H4 亞型組合，不同組合的病毒進(jìn)化關(guān)系不同，表現(xiàn)出明顯的病毒異源性，說明病毒不僅在自然界中發(fā)生了復(fù)雜基因重排，還為其它亞型的AIV 提供基因供體[10-11]。此外，監(jiān)測到的H4 病毒可以造成哺乳動物的感染，并在豚鼠間發(fā)生接觸傳播和空氣傳播，從而對人類健康構(gòu)成潛在威脅[11]。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了在我國持續(xù)開展H4 亞型AIV 監(jiān)測的必要性。

本研究通過對2018 年在山西省家禽養(yǎng)殖場蛋雞拭子樣品中分離到的一株H4N6 亞型AIV，A/chicken/Shanxi/S1452/2018（H4N6）（簡稱CK/SX/S1452/2018）株，對其進(jìn)行了全基因組測序、遺傳進(jìn)化分析、受體結(jié)合特性的分析，并開展了其對BALB/c 小鼠的致病性分析，進(jìn)一步評估了近年來分離的H4N6 亞型AIV對哺乳動物的感染潛力，為持續(xù)開展流行病學(xué)監(jiān)測和評估H4亞型AIV致人感染的風(fēng)險提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒株及實驗動物H4N6 亞型AIV（CK/SX/S1452/2018）由國家禽流感參考實驗室于2018 年從山西省蛋雞養(yǎng)殖場分離得到；9 日齡～11 日齡SPF 雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心；6 周齡SPF雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物中心。

1.2 主要試劑病毒RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO 公司；EasyTaqDNA 聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購自杭州AXYGEN 有限公司；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購自美國Omega公司；測序反應(yīng)試劑盒Big Dye Terminator 3.1 和測序反應(yīng)產(chǎn)物純化磁珠購自美國ABI 公司；H4 亞型雞源陽性血清由本實驗室制備；96 孔板及OPD 購自Invitrogen公司；兩種不同結(jié)構(gòu)的糖鏈：SAα-2,3 Gal和SAα-2,6 Gal 由日本東京大學(xué)Yasuo Suzuki 教授惠贈。

1.3 病毒純化及雞胚半數(shù)感染量（EID50）的測定采用有限稀釋法純化H4N6 亞型AIV，病毒樣品用含青霉素和鏈霉素的PBS 10 倍倍比稀釋，接種于9 日齡～11 日齡SPF 雞胚，37 ℃培養(yǎng)60 h 后收集血凝陽性的最高稀釋度的雞胚尿囊液，相同方法連續(xù)純化3 代后離心分裝，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。純化的病毒用無菌PBS 10 倍倍比稀釋后接種9 日齡～11 日齡SPF 雞胚，每個稀釋度接種5 枚雞胚，37 ℃培養(yǎng)48 h 后檢測各雞胚的血凝情況，根據(jù)Reed-Muench 法計算病毒EID50。

1.4 病毒基因組測序及遺傳進(jìn)化分析利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，65 ℃金屬浴5 min 破壞RNA二級結(jié)構(gòu)，加入流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物（12 bp，5′-AGCAAAAGCAGG-3′）將病毒基因組反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在GeneBank 中下載H4 亞型AIV 基因序列，利用Hoffmann 等的引物及反應(yīng)條件擴增病毒各目的片段[12]，采用DNA 純化和膠回收試劑盒回收目的片段。按照薛振宇等人的方法測序[13]，利用DNAStar中Seqman 軟件包序列分析和拼接，利用DNAStar 中Seqman 軟件包進(jìn)行序列分析和拼接，MEGA6.0 軟件分析病毒全基因組的同源性及HA 和NA 基因的遺傳進(jìn)化過程。

1.5 受體結(jié)合特性試驗按照Qu 等的方法采用固相結(jié)合ELISA 分析CK/SX/S1452/2018 病毒株的受體結(jié)合特性[14]。將病毒尿囊液用β-丙內(nèi)酯滅活后，24 000 r/min 4 ℃超離濃縮2 h 并配制成64 單位病毒抗原。將初始濃度為100 ng/μL 的α-2,3 和α-2,6 糖鏈加入ELISA 酶標(biāo)板中，100 μL/孔，2 倍倍比稀釋11 次后，置于254 nm 紫外光下交聯(lián)10 min，預(yù)冷的PBS 洗滌4 次后按100 μL/孔加入64 單位滅活病毒，4 ℃孵育8 h～10 h；棄去液體后用預(yù)冷的PBST（含1%的Tween20）洗4次，PBS洗1次；每孔加入100 μL 福爾馬林溶液以去除NA 活性。室溫放置30 min 后用相同方法洗滌；以針對該病毒株的雞源陽性血清（1∶600）作為一抗，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h 后以相同方法洗滌；兔抗雞IgG-HRP（1∶1500）作為二抗，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h 后洗滌；以100 μL/孔避光加入OPD 顯色液，以50 μL/孔加入0.5 mol/L 硫酸終止顯色，490 nm 處讀取吸光值。利用GraphPad Prism 5 軟件分析結(jié)果并繪制曲線圖。

1.6 小鼠致病性試驗參照文獻(xiàn)[11]方法，將8 只6周齡SPF 雌性BALB/c 小鼠經(jīng)CO2吸入麻醉后，以106EID50/50 μL 劑量經(jīng)鼻腔感染病毒，同時設(shè)立PBS陰性對照組。感染后第3 d 隨機迫殺3 只小鼠并采集鼻甲、肺臟、脾臟、腎臟和腦，通過雞胚滴定法檢測病毒在小鼠各臟器中的復(fù)制情況；剩余5 只小鼠每天記錄體質(zhì)量變化并觀察其臨床癥狀至感染后第14 d。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2.1.1 病毒基因組核苷酸相似性分析 對CK/SX/S1452/2018 病毒株進(jìn)行全基因組測序，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫Blast進(jìn)行序列相似性分析比對，最終獲得與該病毒株各基因節(jié)段核苷酸同源性最高的病毒株（表1）。結(jié)果顯示，該病毒株各基因節(jié)段來源復(fù)雜，其中表面基因HA 和NA 均來源于H4N6 亞型AIV A/duck/Mongolia/543/2015（H4N6）株，與CK/SX/S1452/2018病毒株HA 和NA 基因的同源性最高，分別為99.23%和99.22%，但發(fā)現(xiàn)其與國內(nèi)近年來監(jiān)測到的家禽源H4 亞型AIV 核苷酸相似性較低；內(nèi)部基因主要來源于鴨或水鳥體內(nèi)分離的H3N3、H4N8、H3N8、H2N8 和H7N3 等亞型AIV，與之相對應(yīng)基因的同源性高達(dá)98.38%～99.90%。對比還發(fā)現(xiàn)，其各基因節(jié)段同源性最高的病毒株均屬歐亞譜系，且與我國周邊各國鴨體內(nèi)分離病毒株各基因的核苷酸同源性最高，因此CK/SX/S1452/2018 病毒株的基因來源可能為野鳥。

表1 與CK/SX/S1452/2018株8個基因節(jié)段同源性最高的病毒株Table 1 The virus strains with the highest homology with CK/SX/S1452/2018

2.1.2 HA 基因序列分析及遺傳進(jìn)化分析 CK/SX/S1452/2018 病毒株HA 基因的編碼區(qū)全長為1 695 nt，編碼564 個氨基酸，HA 基因裂解位點的氨基酸基序為338PEKASR↓GLF，有且僅有一個堿性氨基酸，符合LPAIV 的分子特征。HA 蛋白具有5 個潛在的N-糖基化位點，其中4 個位于HA1 亞基，分是18NYT20、別34NGT36、178NLT180和310NIS312，另外1 個497NGT499位于HA2 亞基。病毒HA 蛋白相關(guān)受體結(jié)合位點比較保守，并未進(jìn)一步獲得結(jié)合人型受體的226L 和228S 突變（H3 numbering），但出現(xiàn)了160A 的突變，可以初步推測該H4N6 亞型AIV 同時具備感染家禽和哺乳動物的能力[15]。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該病毒株HA基因?qū)儆跉W亞分支，但與近期在我國監(jiān)測到的家禽源H4 亞型AIV 株HA 基因遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，核苷酸同源性為93.9%～96.2%；但與野鳥源H4 亞型AIV株HA 基因遺傳關(guān)系較近（圖1），核苷酸同源性為94.7%～99.2%。上述結(jié)果表明，本研究的H4N6 亞型AIV 株HA 基因可能來源于鴨或野鳥H4N6 亞型AIV。

圖1 分離病毒HA基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of HA gene

2.1.3 NA 基因序列分析及遺傳進(jìn)化分析 CK/SX/S1452/2018 病毒株NA 基因編碼區(qū)全長為1 410 nt，編碼469 個氨基酸，未發(fā)現(xiàn)NA 蛋白莖區(qū)發(fā)生氨基酸缺失，但存在5 個潛在的糖基化位點：54NST56、67NFT69、70NIT72、86NLT88、146NGT148和402NWS404。NA 特異性氨基酸位點分析發(fā)現(xiàn)，與神經(jīng)氨酸酶耐藥性相關(guān)位點119E、222I、246A 和292R 仍較保守，未發(fā)生突變，初步推測該H4N6 亞型AIV 未出現(xiàn)對神經(jīng)氨酸酶相關(guān)拮抗劑的耐藥性。病毒株NA 基因在遺傳進(jìn)化關(guān)系上仍屬歐亞分支，但與近期在我國監(jiān)測到的家禽源H4 亞型AIV 株NA 基因遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，核苷酸同源性為90.6%～91.4%；與野鳥源H4 亞型AIV 株NA 基因遺傳關(guān)系較近（圖2），核苷酸同源性為97.5%～99.2%。上述結(jié)果表明，本研究的H4N6 亞型AIV 株NA 基因也同樣可能來源于鴨或野鳥H4N6亞型AIV。

圖2 分離病毒NA基因的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of NA gene

2.1.4 內(nèi)部基因序列分析及遺傳進(jìn)化分析 6 個內(nèi)部基因序列分析結(jié)果顯示，CK/SX/S1452/2018 病毒株P(guān)B2 蛋白氨基酸序列aa271、aa627 和aa701 均未發(fā)生T271A、E627K 或D701N 對哺乳動物致病力增強的突變。其他內(nèi)部基因也未發(fā)現(xiàn)存在增強病毒對哺乳動物致病力的關(guān)鍵氨基酸位點的突變。表明該H4N6亞型AIV 株內(nèi)部的基因進(jìn)化仍比較保守，病毒一直在禽類中流行和循環(huán)，并未經(jīng)過哺乳動物體內(nèi)適應(yīng)的過程。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，其內(nèi)部基因均屬于歐亞分支，且與國內(nèi)近年監(jiān)測到的H4 亞型AIV 核苷酸親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（表1）。推測該病毒內(nèi)部基因最初可能來源于野生鳥類攜帶的AIV。an

2.2 受體結(jié)合特性試驗結(jié)果以往的研究發(fā)現(xiàn)，病毒HA 蛋白與唾液酸受體結(jié)合能力取決于病毒HA 基因受體結(jié)合位點的氨基酸基序，它決定著病毒是否能夠感染家禽或哺乳動物。在本研究中，分析結(jié)果顯示，其相關(guān)受體結(jié)合位點雖然并未獲得226L 和228S突變（H3 numbering），但病毒株出現(xiàn)了T160A 的突變，可能影響其與人型受體的結(jié)合能力[16]。采用固相結(jié)合ELISA 分析了CK/SX/S1452/2018 病毒株的受體結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)其與兩種唾液酸受體均可結(jié)合，但其結(jié)合禽型α-2,3 唾液酸受體和人型α-2,6 唾液酸受體的能力要強于結(jié)合禽型α-2,6 唾液酸受體的能力（圖3）。上述試驗結(jié)果表明，CK/SX/S1452/2018 病毒株同時具備感染家禽和哺乳動物的潛力。

圖3 病毒株CK/SX/S1452/2018唾液酸受體結(jié)合特性分析Fig.3 Receptor-binding property of CK/SX/S1452/2018

2.3 病毒對BALB/c 小鼠的感染性試驗將病毒株以106EID50/50 μL/只劑量鼻腔感染8 只SPF 雌性BALB/c 小鼠，感染后3 d 隨機迫殺3 只小鼠，取其臟器進(jìn)行病毒含量滴定。結(jié)果顯示，該病毒株可未經(jīng)預(yù)先適應(yīng)即可直接感染小鼠，并可在小鼠鼻甲和肺臟中有效復(fù)制，病毒滴度分別為2.8 log10EID50/mL和4.2 log10EID50/mL，但未在小鼠的腦、脾和腎中檢測到病毒的復(fù)制（圖4）。其余的5 只小鼠經(jīng)14 d 連續(xù)觀察，并未發(fā)現(xiàn)較為明顯的臨床癥狀，體質(zhì)量在14 d觀察期內(nèi)與對照組小鼠無明顯差異（圖5）。結(jié)果表明，CK/SX/S1452/2018 病毒株對小鼠呈低致病力，為一過性感染。

圖4 感染后3 d病毒株在BALB/c小鼠臟器中的復(fù)制情況Fig.4 Viral titers in the organs of BALB/c mice at 3 d post-inoculation

圖5 病毒感染BALB/c小鼠后的體質(zhì)量變化Fig.5 Body weight of mice post-inoculation

3 討 論

在自然界，H1N1、H2N2 和H3N2 亞型流感病毒已導(dǎo)致4 次人類流感大流行，目前H1N1 和H3N2 亞型流感病毒仍在人類中活躍傳播。H5 和H7 亞型HPAIV 經(jīng)常在家禽和野鳥中引起嚴(yán)重的疾病暴發(fā)。在過去20 年里，H5 亞型AIV 不僅對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大危害，而且還在多個國家引起了嚴(yán)重的人類感染和死亡[17]。2013 年在中國出現(xiàn)的H7N9 病毒在2017 年突變?yōu)楦咧虏⌒圆《局旰?，不僅在中國多個省份引起雞的流感疫情暴發(fā)，而且進(jìn)一步增強了其對人類的危害[18-19]。

LPAIV 通常不會在動物中引起疾病或死亡，這使其在動物疾病的控制中易被忽視，在自然界悄然進(jìn)化，但它們的流行和蔓延有時也會嚴(yán)重影響家禽的生產(chǎn)效率，也會對人類健康構(gòu)成威脅。2013 年的H7N9 亞型LPAIV 雖然對家禽不致病，但也曾在我國致大量人的感染和死亡[18]。H9N2 亞型LPAIV 不僅可在雪貂中飛沫傳播，而且在多個國家出現(xiàn)人感染的病例報道[20]。此外，攜帶不同NA基因的H10亞型AIV在不同國家也引起人類的感染。說明這些LPAIV 同樣具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

H4 亞型AIV 除可感染禽鳥外，還可感染豬、海豹和小鼠等哺乳動物，近年來也獲得不少感染人的血清學(xué)和病原學(xué)證據(jù)[8-9]。在國家禽流感參考實驗室近年來的流行病學(xué)監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)H4 亞型AIV 在我國的活禽市場和部分水禽養(yǎng)殖場中存在一定的流行，進(jìn)一步的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果說明湖區(qū)水域放養(yǎng)的水禽與野生水鳥類等存在著AIV 的相互傳播。突出了H4 亞型LPAIV 潛在的傳播風(fēng)險以及監(jiān)測禽類和其他動物H4 亞型AIV 的重要性。

本研究發(fā)現(xiàn)2018 年自山西家禽養(yǎng)殖場蛋雞拭子樣品中分離的CK/SX/S1452/2018 是一株野鳥源重組病毒。野鳥作為AIV 許多亞型的自然儲存宿主，在流感病毒的進(jìn)化和傳播過程中發(fā)揮著重要作用，病毒隨著候鳥的遷徙路線傳播擴散。與Liang 等在2009 年～2012 年分離到的H4 亞型AIV 相比，該病毒株HA 裂解位點基因基序仍保持低致病性病毒株特征[11]。對與哺乳動物致病力增強、哺乳動物間傳播能力增強等相關(guān)的特異性關(guān)鍵氨基酸位點的比對，發(fā)現(xiàn)CK/SX/S1452/2018 病毒株與2009 年～2012 年的病毒株在這些位點基本一致，說明分離的這株病毒仍具備在禽類中傳播、流行、遺傳進(jìn)化相對保守的特點。但受體結(jié)合特性試驗發(fā)現(xiàn)，CK/SX/S1452/2018 病毒株同樣具有結(jié)合人型唾液酸受體的能力，即可同時結(jié)合人型和禽型唾液酸受體，但受體結(jié)合特性試驗發(fā)現(xiàn)，CK/SX/S1452/2018 病毒株同樣具有結(jié)合人型唾液酸受體的能力，即可同時結(jié)合禽型α-2,3和人型α-2,6兩種唾液酸受體的能力，進(jìn)一步提示了對H4 亞型AIV 感染防控的公共衛(wèi)生學(xué)意義。因此，應(yīng)當(dāng)加強對如H4亞型AIV等LPAIV的監(jiān)測力度，關(guān)注其對哺乳動物致病力的變化，防止其對人類公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重破壞。