歐李(Cerasus humilis)內(nèi)生固氮細(xì)菌篩選、鑒定及特性研究

白 潔， 姚 拓*， 雷 楊， 王占軍， 王辛有， 苑力暉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070； 2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所， 寧夏回族自治區(qū) 銀川 750000；3.蘭州植物園， 甘肅 蘭州 730070)

歐李(Cerasushumilis)是一種生長于我國北方荒漠草原、沙地邊緣的矮灌木。具有抗寒、抗旱，再生能力強(qiáng)的特點(diǎn)。由于歐李成叢快、覆蓋率高、根系發(fā)達(dá)，常被選做生態(tài)脆弱區(qū)的恢復(fù)樹種[1]。王鵬飛等[2]研究發(fā)現(xiàn)，栽植歐李對黃土丘陵溝壑區(qū)灌下土壤理化性質(zhì)有不同程度改善。此外，歐李枝葉質(zhì)地柔軟，含有豐富的鈣、糖和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是牛羊所喜食的優(yōu)質(zhì)飼料[3]?；诖?，歐李對緩解生態(tài)建設(shè)和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展之間的矛盾具有重要意義[4]。

歐李經(jīng)過長期的自然選擇，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可在土壤較為貧瘠的條件下正常生長[5]。趙貝貝對歐李樹體礦質(zhì)營養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，歐李主根與須根系中氮含量最高，高于磷、鉀、鎂、鐵等元素[6]，推測定殖于其根系中的固氮微生物發(fā)揮著重要作用。因此從其根系中分離篩選出內(nèi)生固氮菌的概率較高。定殖于植物根系的內(nèi)生固氮菌，占據(jù)著植物組織內(nèi)有利于營養(yǎng)供應(yīng)和微環(huán)境穩(wěn)定的生態(tài)位，避免了化合態(tài)氮的抑制及土著微生物的競爭，較根外環(huán)境更有利于形成高效固氮系統(tǒng)，可充分發(fā)揮固氮效能[7-8]。該系統(tǒng)為宿主植物提供氮素來源的同時(shí)增加了土壤肥力[9]。方華舟等[10]用含固氮菌的復(fù)合菌劑處理稻田土壤后，有效促進(jìn)了土壤氮、磷、鉀轉(zhuǎn)換，提高了土壤養(yǎng)分含量。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生固氮菌還可通過溶磷、分泌植物生長素(Indole acetic acid,IAA)和鐵載體等改善宿主植物營養(yǎng)吸收，進(jìn)而促進(jìn)植物生長并提高產(chǎn)量[11-12]。韓梅等[13]從健康玉米植株中分離純化出2株內(nèi)生固氮菌，接種后發(fā)現(xiàn)對玉米苗期的生長有明顯的促進(jìn)作用。

目前，國內(nèi)外學(xué)者在農(nóng)作物、牧草和林木中都已分離獲得內(nèi)生固氮菌[14-17]，但對于荒漠草原灌木歐李內(nèi)生固氮菌還缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究對從歐李根系分離獲得的內(nèi)生固氮菌進(jìn)行固氮及其他特性研究，篩選出固氮能力較強(qiáng)的菌株，通過16S rDNA基因序列比對確定菌株的分類地位,以期為歐李固氮微生物接種劑的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 2021年1月于寧夏回族自治區(qū)銀川市永寧縣(38.25° N，106.07° E，海拔1 110 m)挑選生長旺盛的3株3年樹齡歐李植株，距地面約35 cm處，截取其根系，裝入無菌自封袋，放置于冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱中保存，備用。

1.1.2培養(yǎng)基 無氮(Nitrogen free medium，NFM)培養(yǎng)基[18]用于內(nèi)生固氮菌的分離及固氮酶活性測定；King氏液體培養(yǎng)基[19]用于內(nèi)生固氮菌分泌IAA特性測定；無機(jī)磷(National botanical research institute’ s phosphate，NBRIP)液體培養(yǎng)基[20]用于內(nèi)生固氮菌溶無機(jī)磷特性測定；蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基[21]用于內(nèi)生固氮菌解有機(jī)磷特性測定；LB(luria bertani)固體培養(yǎng)基[19]用于內(nèi)生固氮菌的保存與培養(yǎng)。

上述培養(yǎng)基均在121℃下，滅菌26 min，固體培養(yǎng)基傾倒于9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生固氮菌分離 將3株歐李根系置于水下沖洗干凈表面泥土和其他雜質(zhì)，移入無菌超凈工作臺(tái)，用無菌水沖洗3次，后用無菌濾紙吸干表面水分。進(jìn)行75%乙醇3 min，2.5%次氯酸鈉7 min，75%乙醇20 min的三步表面消毒。消毒后的植物根系，用無菌水沖洗6次，后用無菌濾紙吸干表面水分，以最后1次無菌水洗滌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌長出，以此檢測消毒是否徹底。將3株滅菌根系分別用無菌刀片切成約為1 g的小塊，用高壓滅菌后的研磨棒和研磨缽在9 mL的無菌水中研磨，每株植物根系3次重復(fù)。吸取上述織組懸浮液0.1 mL涂布于NFM平板上。接種平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d。

1.2.2內(nèi)生固氮菌的初篩 選取NFM培養(yǎng)基中生長較快，菌落形態(tài)較大的不同單菌落，進(jìn)行反復(fù)四區(qū)劃線[22]，純化后的菌株即為固氮菌。將固氮菌懸浮于20%甘油，保存至—80℃冰箱中備用。

1.2.3內(nèi)生固氮菌固氮酶活性及促生特性測定 內(nèi)生固氮菌固酶活性采用乙炔還原法測定[23]；溶磷特性采用鉬銻抗比色法測定[24]；合成植物生長素IAA特性采用Salkowski法測定[25]。

1.2.4優(yōu)良內(nèi)生固氮菌株初步鑒定 16S rDNA基因序列擴(kuò)增：通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[26]。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×Taq PCR Master Mix 25 μL,DNA模板4 μL、引物各1.5 μL和ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物由蘭州天啟基因生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果在Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫中與模式菌株進(jìn)行同源性比對。選取相似度超過95%的模式菌株相應(yīng)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，使用MEGA 7.0軟件中ClustalW進(jìn)行多重比對后，利用鄰近法(Kimura 2-parameter模型；Bootstrap 1000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理計(jì)算；SPSS 20.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，顯著性水平為P<0.05；圖中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”并使用Origin 2021作圖；利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李根系內(nèi)生固氮菌的初步篩選

從歐李根系內(nèi)分離出20株內(nèi)生固氮菌，分別為NS1 14-2，NS1 14-1，NS 8，NS 22，NS 25，NS 26，YNS 3，YNS 10，YNS 6，YNS 1，YNS 4，WNS 26，WNS 24，WNS 22-1，WNS 21，NNS 15，NNS 18，NNS 17，NNS 14和NNS 19。

2.2 歐李內(nèi)生固氮菌固氮酶活性

對20株歐李內(nèi)生固氮菌的固氮酶活性進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，固氮酶活性范圍在31.45～424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1之間，其中菌株NS 25固氮酶活性(424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1)顯著高于其他菌株(P<0.05)。其次為菌株NS1 14-2(323.36 nmol C2H4·h-1·mL-1)和菌株NS1 14-1(305.63 nmol C2H4·h-1·mL-1)。此外固氮酶活性在200～300 nmol C2H4·h-1·mL-1之間的菌株有7株，分別為NS 8，NS 26，YNS 6，YNS 1，WNS 21，NNS 15和NNS 19。其他菌株固氮酶活性均小于200 nmol C2H4·h-1·mL-1。結(jié)果表明歐李根內(nèi)具有豐富的固氮微生物資源(圖1)。

圖1 歐李內(nèi)生固氮菌固氮酶活性

2.3 歐李內(nèi)生固氮菌溶磷和分泌IAA特性

通過測定20株內(nèi)生固氮菌合成植物生長素IAA能力發(fā)現(xiàn)，植物生長素IAA合成量在3.86～47.00 μg·mL-1之間，菌株NS 22合成IAA量(47.00 μg·mL-1)顯著高于其他菌株(P<0.05)。其中合成IAA量大于20 μg·mL-1的菌株有5株分別為NS1 14-2，NS 22，NNS 18，NNS 17和NNS 14(圖2)。

圖2 歐李內(nèi)生固氮菌分泌IAA

分離菌株解有機(jī)磷量在26.62～99.18 μg·mL-1之間，各菌株培養(yǎng)液pH在3.42～5.52之間，菌株YNS 4(99.18 μg·mL-1)，NS 8(78.45 μg·mL-1)和YNS 6(72.88 μg·mL-1)解有機(jī)磷量顯著高于其他菌株(P<0.05)，剩余菌株解有機(jī)磷量均小于65 μg·mL-1(圖3)。分離菌株溶無機(jī)磷量測定中，各菌株培養(yǎng)液pH值在5.33～6.82之間，菌株WNS 21(20.31 μg·mL-1)和NNS 14(16.12 μg·mL-1)溶無機(jī)磷量顯著高于其他菌株(P<0.05)，剩余菌株溶無機(jī)磷量均小于17 μg·mL-1(圖4)。供試的20株內(nèi)生固氮菌均能夠同時(shí)解有機(jī)磷和溶無機(jī)磷，不同菌株溶磷量不同。另外，這些內(nèi)生固氮菌表現(xiàn)出解有機(jī)磷量大于溶無機(jī)磷量。

圖3 歐李內(nèi)生固氮菌解有機(jī)磷

圖4 歐李內(nèi)生固氮菌溶無機(jī)磷

2.4 歐李優(yōu)良內(nèi)生固氮菌初步鑒定

篩選10株固氮酶活性大于200 nmol C2H4·h-1·mL-1的菌株進(jìn)行鑒定，將測序結(jié)果在Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫中與模式菌株進(jìn)行相似性比對。結(jié)果顯示，菌株NS1 14-1，NS1 14-2與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)模式菌株相似度分別為99.38%和98.90%，并處于同一進(jìn)化分支；菌株NS 25和NS 26與副地芽孢桿菌(Bacillusparalicheniformis)模式菌株相似度分別為99.11%和98.77%，并處于同一進(jìn)化分支；菌株YNS 1與耐寒短桿菌(Brevibacteriumfrigoritolerans)的相似度為99.11%，并處于同一進(jìn)化分支；菌株WNS 21，NNS 15與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)模式菌株相似度分別為99.14%和99.36%，并處于同一進(jìn)化分支；菌株NS 8與梓樹類芽孢桿菌(Paenibacilluscatalpae)模式菌株相似度為98.47%，并處于同一進(jìn)化分支；菌株YNS 6與堅(jiān)強(qiáng)細(xì)胞芽孢桿菌(Cytobacillusfirmus)模式菌株相似度為98.86%，并處于同一進(jìn)化分支；NNS 19與地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)相似度為99.05%，與副地芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌模式菌株處于同一進(jìn)化分支(圖5)。

圖5 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建10株內(nèi)生固氮菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

高效利用固氮微生物的前提是優(yōu)良菌株的挖掘與鑒定。本研究以歐李根系為研究材料，利用無氮培養(yǎng)基，分離獲得20株內(nèi)生固氮菌。從中篩選出10株固氮酶活性在200～450 nmol C2H4·h-1·mL-1之間的菌株，通過16S rDNA基因序列進(jìn)行比對，這10株內(nèi)生固氮菌分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、細(xì)胞芽孢桿菌屬(Cytobacillus)和短桿菌屬(Brevibacterium)。類芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬曾多次從小麥、珠芽蓼、蠶豆和馬鈴薯等植物中獲得[27-31]。說明該菌屬在植物體內(nèi)生長數(shù)量多,是內(nèi)生固氮菌的優(yōu)勢菌群，具有較強(qiáng)的地域廣泛性和作物適應(yīng)性，這對于今后微生物接種劑的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。

在固氮酶活性測定中，固氮酶活性最高為菌株NS 25(424.81 nmol C2H4·h-1·mL-1)。傅曉方等[32]從玉米中分離內(nèi)生固氮菌，固氮酶活性最高為591.9 nmol C2H4·h-1·mL-1；李倍金等[33]從高羊茅根系中分離內(nèi)生固氮菌，固氮酶活性最高為2 865 nmol C2H4·h-1·mL-1，表明宿主植物種類不同，可能是內(nèi)生固氮菌固氮酶活性出現(xiàn)差異的原因之一。此外內(nèi)生固氮菌NS 25被初步鑒定為副地芽孢桿菌，然而目前關(guān)于副地芽孢桿菌的固氮能力的研究卻鮮見報(bào)道。Ramírez-Cario等[34]研究發(fā)現(xiàn)副地芽孢桿菌對致使植物感染枯萎病的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和早疫病的鏈格孢(Alternariaalternata)均具有一定的拮抗能力[35]。Anand等[36]將固氮菌接種于鳳梨后，可顯著增加其葉片中的氮含量。推測該菌株在為歐李提供氮源方面發(fā)揮出積極作用外，對歐李真菌性病害的發(fā)生也具有一定的防治作用。

本研究從歐李根系中分離的內(nèi)生固氮菌，除具有豐富的固氮酶活性之外，還兼具分泌IAA和溶磷的能力。分泌植物生長素IAA的菌株可通過刺激植物根毛形成，增加側(cè)根和主根數(shù)量及長度，形成一個(gè)高度分枝的根系系統(tǒng)，從而增強(qiáng)植物對礦質(zhì)營養(yǎng)和水分吸收的能力，并為其他有益微生物附生創(chuàng)造有利條件[37]。Ying等[38]研究發(fā)現(xiàn),IAA產(chǎn)生菌(Pseudomonassp.和Burkholderiasp.)使擬南芥幼苗根系高度分枝，根系變長。本研究分離的內(nèi)生固氮菌均具有合成IAA的能力，如將這些菌株接種于歐李根部，對于歐李在極端環(huán)境下吸收更深層土壤中的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)對其固著土壤，發(fā)揮治理水土流失的生態(tài)作用具有重要意義。有研究證明，具有溶磷作用的內(nèi)生菌，能夠?qū)ν寥乐杏袡C(jī)磷與難溶性磷酸鹽進(jìn)行溶解[39]，有利于宿主植物在磷素較少的土壤中生長。陸藍(lán)翔等[40]從樟樹中分離獲得2株溶磷能力較強(qiáng)的菌株(ZS-1和ZS-3)，在接種樟樹扦插苗后，可有效地促進(jìn)其生長。本研究分離的內(nèi)生固氮菌解有機(jī)磷量最高為99.18 μg·mL-1，溶無機(jī)磷量最高為20.31 μg·mL-1。說明此次分離的內(nèi)生固氮菌株還可通過提高歐李對環(huán)境中磷元素吸收利用來促進(jìn)其生長。

另外，綜合20株內(nèi)生固氮菌在固氮酶活性、分泌IAA和溶磷特性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分不同種屬菌株、相同種屬菌株間的特性測定結(jié)果存在差異，這可能與菌株自身遺傳特性有關(guān)[41]。此外，不同菌株對最適生長的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的需求存在很大差異[42]，可能也會(huì)導(dǎo)致此現(xiàn)象的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究從歐李根系中分離獲得的20株內(nèi)生固氮菌具有固氮酶活性和其他特性(溶磷和分泌植物生長素IAA)，對歐李的生長具有一定的促生潛力。從中篩選10株優(yōu)良內(nèi)生固氮菌經(jīng)鑒定共有芽孢桿菌屬(Bacillus)7株、短桿菌屬(Brevibacterium)1株、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)1株和細(xì)胞芽孢桿菌屬(Cytobacillus)1株。本試驗(yàn)豐富了固氮微生物接種劑菌種資源庫。