超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定蟲草素和腺苷

【摘要】 為擴大檢測范圍，滿足痕量蟲草素和腺苷含量的檢測，建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定蛹蟲草制品中蟲草素和腺苷的含量，同時對其進行測定低限及回收率的驗證，結(jié)果表明其線性范圍0.01 μg·L-1～5 μg·L-1的相關(guān)系數(shù)均能達到0.9995以上，蟲草素和腺苷的測定低限均為0.05 μg·L-1，并具有特異性顯著，靈敏度較高等特點。

【關(guān)鍵詞】 蛹蟲草;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;蟲草素;腺苷

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2022.01.029

Determination of Cordycepin and Adenosine by Ultra High Performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry

WANG Guan-yu

（Fushun Food Inspection and Testing Center，F(xiàn)ushun 113000，China）

Abstract： To expand detection range，in order to meet the needs of the less cordycepin and adenosine testing，the UPLC-MS/MS method was established for the determination of cordycepin and， adenosine in Cordyceps militaris products. The determination limit and recovery rate of cordycepin， adenosine and cordycepin in cordyceps militaris were verified simultaneously. The results showed that their linear ranges of 0.01 μg·L-1～5 μg·L-1 were above 0.9995，The limit of detection lower was 0.05 μg·L-1. It has the characteristics and high sensitivity.

Key words： Cordyceps;UPLC-MS/MS;cordycepin;adenosine

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草，與冬蟲夏草具有相似的生物活性成分，主要包括蟲草素、腺苷、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、有機酸和核苷類物質(zhì)等[1-3]。新資源食品研究表明因其多種功能性活性成分協(xié)同作用，對治療多種慢性疾病有顯著影響，具有抗腫瘤、治療白血病、提高免疫力、治療心血管相關(guān)疾病、抑菌消炎等作用[4-5]，但由于化學(xué)合成難度大成本高，導(dǎo)致價格昂貴。因此，蟲草素和腺苷常作為質(zhì)量等級的評價指標，準確且便捷的檢測方法對蛹蟲草及其制品研究具有重要意義。

目前已知的蟲草素和腺苷的提取方法有浸提法、超聲法、回流法以及索氏提取法等[6]，一般提取蟲草素的方法都能一并獲得腺苷，并且結(jié)果表明水比乙醇更利于提取蟲草素。本文通過前期提取效率、提取結(jié)果以及提取方法的易操作性的比對，選擇超聲法提取，而蟲草素和腺苷的檢測方法有液相色譜法（紫外檢測器）、薄層色譜法等，受液相色譜等儀器靈敏度的限制，檢測限僅能達到10 mg/kg。對于添加量不足千分之一的蛹蟲草制品來說，以上方法已經(jīng)無法滿足其微量的功能性成分檢測要求，本文通過統(tǒng)一采用超聲提取前處理技術(shù)及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究測定蟲草素和腺苷的含量，不僅降低檢測低限從而擴大檢測范圍，更能為整合其他功能性成分的檢測方法提供一個方向。

1.1 儀器與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（ACQUITY?? UPLC-TQD，美國Waters公司）;電子天平（ML204T，梅特勒-托利多公司）;超聲波清洗器（Prima公司）;菌株（蛹蟲草來自沈陽師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所）;蟲草素、腺苷標準品（美國sigma公司）。

1.2 液相色譜分離條件（見表1）

色譜柱：ACQUITY UPLC?BHE-C18柱，2.1×50 mm，1.7 μm;流動相[7]：A）0.1%甲酸水溶液，B）甲醇;流速：0.2 mL·min-1;柱溫：30 ℃;進樣量：10 μL。

1.3 質(zhì)譜檢測條件

質(zhì)譜系統(tǒng)：Xevo TQD;離子化模式：ESI+;毛細管電壓：3.5 KV;霧化氣溫度：350 ℃;霧化氣流速：650 L/h;錐孔氣流速：50 L/h。

1.4 標準品的制備

準確稱取蟲草素和腺苷各10.0 mg，用水定容至100 mL，配制成100 mg·L-1的儲備液，將上述儲備液混合后逐級稀釋至所需濃度。

1.5 樣品的制備

通過優(yōu)化NY/T 2116—2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定 高效液相色譜法》使提取更充分，準確稱取粉碎后樣品0.5 g，加入純水20 mL，超聲波提取120 min，5000 r·min-1，離心5 min，取上清液，并重復(fù)提取一次，定容至50 mL，待上機測定[8]。

1.6 檢測低限

本試驗采用直接配制純標液和陰性樣品提取液配制的標準溶液工作兩種曲線來測定方法測定低限，將含兩種被測物的混合標準儲備液分別用水及提取液稀釋，分別配制成含量為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg·L-1的標準工作液，按1.2和1.3所確定的色譜-質(zhì)譜條件進行測定，同時繪制標準工作曲線。以信噪比（S/N）>10時蟲草素和腺苷最小含量為液相色譜-質(zhì)譜法的測定低限。

1.7 回收率

準確稱取一定量樣品，用微量移液器準確加入一定量的兩種待測物混合標準溶液，配成0.05g·kg-1，0.1g·kg-1和0.5g·kg-1三個濃度水平進行回收實驗，按上述實驗步驟進行處理和測定，并計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗以被測物在色譜柱上的峰形、靈敏度和保留時間穩(wěn)定性等為考察指標，對流動相比例進行了比較。由于蟲草素和腺苷均溶于水，且正離子模式下0.1%甲酸水溶液能更好地電離，并結(jié)合液相色譜法測定蟲草素和腺苷的參考條件，確定大比例0.1%甲酸水溶液為流動相A，在兼顧良好分離效果和離子化效率的同時，我們在50%甲酸水-甲醇比例基礎(chǔ)上來測試調(diào)整，最終選擇進行梯度淋洗。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜采用自動連續(xù)進樣方式進行全掃描檢測，得到被測物的一級質(zhì)譜圖及其母離子，再用高純惰性氣體轟擊該母離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及相應(yīng)子離子。結(jié)果表明，兩種物質(zhì)均是正離子模式，并且響應(yīng)值高于負離子模式，因此，本方法選擇正離子監(jiān)測的方式。采用本文中1.3質(zhì)譜檢測條件，再利用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式對已選定的定性離子對和定量離子對進行相關(guān)質(zhì)譜毛細管電壓、碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達到最強，所得最佳質(zhì)譜條件參數(shù)詳見表2。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下兩種被測物的0.5 μg·L-1混合標準溶液定量離子對和定性離子對以及Tic圖見圖1-圖3。

2.3 樣品前處理條件的選擇

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜能夠很好地抗基質(zhì)干擾，結(jié)合蟲草素和腺苷的結(jié)構(gòu)特點，兩者均溶于水和乙醇，比較兩者結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，乙醇提取或部分乙醇提取的目標物提取率較低，水提取效果更好[10]，因此，采用水提取法處理后直接進樣的方法。經(jīng)試驗，結(jié)果令人滿意且水提取法更干凈、更安全、更易于推廣。

2.4 標準曲線、測定低限的確定

考慮實際樣品測定，分別采取純試劑和陰性基質(zhì)樣品提取液配制相同濃度的混合標準工作液，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度（μg·L-1）為橫坐標畫曲線，并在相同的儀器參數(shù)下測定目標物的響應(yīng)值并進行比較。實驗結(jié)果表明：純試劑配制的混合標準工作溶液的響應(yīng)值和陰性基質(zhì)提取液配制而成的混合標準工作溶液的響應(yīng)值無明顯差異，只是峰形有拖尾現(xiàn)象存在，其程度對分析結(jié)果影響不大，所以選擇純試劑配制的混合標準曲線。

用純試劑配制成的質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg·L-1混合標準工作溶液，采用外標法定量，相關(guān)線性良好，而且腺苷的信噪比要高于蟲草素，在濃度為0.01 μg·L-1時腺苷信噪比（S/N）>10，在濃度為0.05 μg·L-1時，蟲草素信噪比（S/N）>10，為便于操作，確定統(tǒng)一的檢測低限為0.05 μg·L-1，檢測低限為5 μg/kg，相關(guān)參數(shù)見表3。降低檢測低限有助于蛹蟲草制品等相關(guān)食品的蟲草素和腺苷成分的檢測，為其保健功能提供重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。

2.5 精密度與回收率

本研究通過陰性樣品添加0.05 μg·L-1，0.1 μg·L-1和0.5 μg·L-1濃度點進行三次測試，該方法檢測蛹蟲草制品中蟲草素和腺苷的加標回收結(jié)果見表4。兩種目標物的平均回收率為98.0%～108.0%，RSD為0.41%～1.92%，表明該試驗方法的回收率和重現(xiàn)性好。

2.6 不同方法分析

試驗中，作者分別用液相色譜法[11]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定了珍硒蟲草粉中蟲草素和腺苷含量，取6次測量平均結(jié)果，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蟲草素和腺苷結(jié)果明顯大于液相色譜法檢測結(jié)果，這是因為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，響應(yīng)效果好，并且取樣量少，提取更充分。

2.7 樣品分析

將五種不同酒基中添加蛹蟲草的樣品按上述方法進行分析，結(jié)果如表6，其中兩組數(shù)據(jù)結(jié)果均低于NY/T 2116—2012高效液相色譜法測定的定量限30 mg/kg，另外《關(guān)于批準蛹蟲草為新資源食品的公告》中也提及食用量≤2克/天，因此液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蛹蟲草制品中的蟲草素和腺苷具有可行性。

3 討論

本實驗最終結(jié)果表明采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蛹蟲草及其制品的方法簡單，靈敏度更高，結(jié)果更準確，適用于測定蛹蟲草及其制品中蟲草素和腺苷的含量。并且通過進一步的研究，蛹蟲草中蟲草酸、噴司他丁等其他功能性成分也可以通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定[12]，因此，此文為整合蛹蟲草中功能性成分的測定方法打下基礎(chǔ)，為以后的研究提供方法依據(jù)。

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【作者簡介】

王冠宇，女，1986年出生，工程師，學(xué)士，研究方向為食品檢驗。