應用同步輻射X射線多模態(tài)成像研究死亡延遲時間對腦組織染色的影響

燕 鑫 蔡小青 湯喬偉 周 峰 諸 穎 王麗華 胡 鈞,3,4

1（中國科學院上海應用物理研究所中國科學院微觀界面物理與探測重點實驗室 上海 201800）

2（上?？萍即髮W 上海 201210）

3（中國科學院上海高等研究院基礎交叉研究中心張江實驗室 上海 201210）

4（中國科學院大學 北京 100049）

人類大腦是一個龐大的復雜體系，有近千億神經元，神經元之間如何連接以及錯誤連接如何導致嚴重的神經性疾病，人類迄今仍未探明其中奧秘。阿爾茨海默綜合征、帕金森綜合征以及亨廷頓綜合征等神經退行性疾病已嚴重危害人類健康，因此探索大腦運行機制、尋找相應的治療方法迫在眉睫［1］。國際上美國腦科學計劃（BRAIN Initiative）、歐洲腦計劃（The Human Brain Project）以及日本腦計劃（Brain/Minds Project）均致力于此［2］。中國的腦計劃（China Brain Project）研究也已啟動，該計劃有望幫助我們理解大腦不同區(qū)域的細胞類型和神經元細胞之間的連接方式，同時對腦功能的神經環(huán)路基礎也將有一個全方位的認識［3］。目前人腦的結構及其功能主要依賴于光學、核磁等商業(yè)化技術來解析。然而，受限于成像技術的視場、分辨率、速度等，目前仍難以在單細胞水平上對人腦組織進行快速高分辨成像來獲得人腦的精細結構圖像，從而無法進一步了解腦相關疾病與神經細胞變化之間的相互關系［4］。近年來，基于大科學裝置的先進成像方法——同步輻射X射線成像技術或將成為繪制人腦介觀尺度連接組圖譜的重要手段。相較于光學成像來說，同步輻射X射線成像擁有各向同性分辨率，成像分辨率不受Z軸限制；穿透深度高，可滿足mm3體積大小的組織塊成像；成像速度快（1 mm3·min-1）等特點。上述優(yōu)點使其大大降低了多組數(shù)據(jù)配準的工作量和難度，針對于人腦成像，可大大節(jié)省數(shù)據(jù)獲取的時間，這也是目前成像速度最快的三維成像手段［5］。

對人腦來說，一些常規(guī)的熒光標記技術，如轉基因動物，基于腺病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）、狂犬病毒（Rabies Virus，RV）等病毒標記技術無法用于活體人腦組織標記，這極大地限制了熒光成像技術在人腦連接圖譜研究上的應用。高爾基染色法是基于重金屬Cr、Hg和Ag的腦組織神經細胞的染色標記方法，適用于同步輻射X射線腦組織成像。但捐贈的人腦組織存在死亡延遲時間（Postmortem Delay，PMD），大部分捐贈的人腦PMD在6~8 h，有些甚至在數(shù)天之久［6］。腦組織的死后變化是不可避免的，導致難以辨別大腦中精細結構的變化是死前的生理性改變還是PMD造成的改變［6］。因此，PMD是影響人腦組織高爾基染色的一個關鍵因素，但PMD如何影響人腦組織神經元的高爾基染色尚不明確。此外，對比未經灌注與0.9%NaCl溶液灌注過的大腦染色情況，未經灌注的大腦染色后血管會影響神經元染色后成像的信噪比，同時，經過福爾馬林或4%多聚甲醛溶液固定過的腦組織也會導致膠質細胞染色，影響高爾基染色的效果［7］。

本工作采用離體后不同放置時間的小鼠腦組織來模擬人死亡后腦神經細胞的變化，設置不同的時間間隔，采用高爾基染色、尼氏染色對取腦后不同放置時間的小鼠大腦皮層區(qū)域進行染色和光學顯微鏡成像，利用上海光源BL13HB成像線站的同步輻射X射線微米CT成像技術對小鼠大腦皮層區(qū)域的錐體神經元進行高分辨率的X射線成像，獲得取腦后不同放置時間小鼠大腦皮層區(qū)域的同步輻射X射線三維成像圖，探究小鼠大腦皮層區(qū)域錐體神經元的形態(tài)結構隨時間的變化規(guī)律［8］。該工作有望對人腦組織高爾基染色方法的建立和同步輻射X射線人腦成像奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

HITO Golgi-cox Optimstain Kit（高爾基試劑盒），Hito Dual-safe Gelatin-coated Slide購自上海南科生物科技有限公司；二甲苯，無水乙醇，多聚甲醛，蔗糖購自國藥集團化學試劑有限公司；尼氏染液購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗器材

直立式顯微鏡Axio Imager 2，德國ZEISS公司；石蠟包埋機EG 1150，德國徠卡公司；冷凍切片機Leica CM1950，德國徠卡公司。

1.3 實驗動物

8周齡C57小鼠，雌性，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，SPF級，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗符合動物實驗的倫理學標準，并經上海中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（批準號：ACSHU-2014-200，2014年7月15日批準）。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

8周齡的成年C57雄性小鼠飼養(yǎng)在動物實驗室恒溫層流架中，合籠飼養(yǎng)，每籠隨機分配5~6只，給予足夠的水和飼料供它們自由攝取。所有小鼠隨機分為7組，用于不同需求的染色。腹腔注射過量的1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，使其失去知覺，仰臥位置于解剖臺上。由腹部開口直至打開胸腔，剝離心包膜暴露出心臟，將針頭插入心尖處，固定好灌注所需針頭，剪斷左心室，持續(xù)勻速緩慢灌注40 mL生理鹽水，確保小鼠體內血液得到充分置換，直至肝臟由棕褐色變?yōu)榈咨?，停止灌注。小鼠灌注后，立即手術剝離小鼠的整個腦組織并保持其完整性，用生理鹽水洗滌后，浸入其中，置于室溫中保存。

2.2 Golgi-Cox染色

全腦組織室溫下放置0 h、12 h、60 h后取出，置于新配制的Golgi-Cox染色液中，鋁箔紙遮光，在25℃培養(yǎng)箱中染色96 h。染色完成后將其沉入30%蔗糖溶液中，4℃低溫脫水3 d，每24 h換液一次。用于光鏡觀察的樣品用冷凍包埋劑包埋，使用冷凍切片機獲得100μm腦組織薄切片置于載玻片上，依次浸入超純水，還原顯色劑，50%、70%、100%乙醇中脫水，然后在二甲苯中透明，最后封片低溫保存。該實驗主要采用蔡司光學顯微鏡，獲取腦組織樣本切片的皮層區(qū)5×、10×、20×、40×和100×（油鏡）的圖像。實驗中得到的原始圖像經過ImageJ處理，實現(xiàn)神經元的Sholl analysis和神經元樹突棘的密度統(tǒng)計，并對神經元樹突棘的統(tǒng)計結果進行Ordinary單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2.3 尼氏染色

冷凍切片機將冷凍包埋的腦組織切成50μm的薄片，置于培養(yǎng)皿中進行浮片染色。超純水洗滌3~5 s后，加入尼氏染液進行染色，放置在37°C培養(yǎng)箱中恒溫染色15~20 min，使其染色更均勻。染色完成后用超純水洗滌兩次，再分別用50%、75%、100%乙醇脫水，將浮片轉移至載玻片，浸泡在充滿二甲苯的染色缸中透明后封片，采用蔡司光學顯微鏡拍攝40×圖像以觀察染色情況，使用ImageJ對原始圖像進行二值化以獲得染色細胞所占面積比，對其結果進行Ordinary單因素方差分析。

2.4 同步輻射X射線微米CT成像

本實驗在上海同步輻射光源（Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF）的X射線生物醫(yī)學成像光束線BL13HB完成，主要通過局部CT、相襯成像等實現(xiàn)在生物醫(yī)學、材料科學和古生物學的應用研究，可以實現(xiàn)0.8μm的空間分辨率和1 ms的時間分辨率［9］。通過X射線微米CT成像實現(xiàn)低劑量、無損、高分辨率、動態(tài)和三維的X射線成像，以了解軟組織的內部微觀結構［10-11］。

用于同步輻射X射線成像的腦組織樣品采用Golgi-Cox染色，染色后將全腦依次浸入超純水，還原顯色劑，30%、50%、75%、90%、95%、100%酒精、無水乙醇-二甲苯（1:1）、二甲苯和石蠟中依次脫水后，將全腦包埋在石蠟中并在室溫下儲存，成像之前將其切成1 mm的厚切片。

在實驗過程中，對皮層區(qū)腦組織的局部區(qū)域進行了斷層顯微成像，將樣品固定在樣品臺的中央，并保證其與光路垂直。為了獲得最佳的神經元相位對比圖像，采用單色光X射線進行成像，最佳能量為20.0 keV。進行局部CT掃描時，樣品到探測器的距離為5 cm，旋轉臺每隔0.1°旋轉180°，曝光時間為200 ms，獲取1 800張圖像。在拍攝過程中需要同時采集光路中無樣品時的白場圖像和無光照射時的暗場圖片。

所有二維原始投射圖像使用ImageJ和ImageJ Plus圖像處理軟件進行處理，考慮到腦組織中不同的結構特征和灰度分布，通過調整對比度、設置適當?shù)臑V波參數(shù)等方法，降低圖像背景噪聲獲取最佳的投影圖像，利用Octopus實現(xiàn)神經元的重構，結合可視化軟件Amira可視化小鼠腦中神經元的分布［12］，顯示小鼠腦矢狀面中不同層次的神經網絡的渲染。

3 實驗結果與討論

3.1 Golgi-cox染色光學成像

1873年，卡米洛·高爾基發(fā)明了高爾基染色法，可以觀察完整神經組織的神經元細胞形態(tài)和組織結構，高爾基也因此在1906年獲得諾貝爾醫(yī)學獎。高爾基染色至今仍是神經元染色的金標準，為神經科學的發(fā)展作出了巨大貢獻。目前普遍認為，高爾基染色法作為經典的神經元染色方法，能夠隨機標記3%~5%的神經元，但可以顯示出神經元的完整形態(tài)結構［13-14］。高爾基染色法經過自誕生以來一百多年的改進和發(fā)展，主要發(fā)展為三大類：快速高爾基染色、Golgi-Kopsch染色和Golgi-Cox染色［15］。Golgi-Cox染色神經元的基本原理尚不完全清楚［16］，改善染色方法的因素也不確定，如灌注方式、溫度和時間等均會影響染色效果，因此優(yōu)化條件以改進Golgi-Cox染色。Golgi-Cox染色［17］的效果會受到未灌注腦組織中血管的影響，染色的血管與神經元交織在一起，增加了圖像的背景噪聲。通過改良Golgi-Cox染色法的時間，大大降低血管被標記的概率，提高光鏡下圖像的信噪比。該實驗采用HITO染色試劑盒，改進后的Golgi-Cox染色方便、高效。

對取腦后間隔不同時間的腦組織進行Golgi-Cox染色（圖1（a））切片后，用光鏡對腦組織切片中的皮層區(qū)進行光學顯微成像，獲得小鼠大腦皮層區(qū)域錐體神經元成像圖（圖1（b）），并對其神經元形態(tài)的變化畫出了示意圖，以便更加清晰直觀地觀察神經元的形態(tài)變化。由此可見，取腦后間隔不同時間對其進行神經元染色，在12 h后被浸染的神經元明顯減少、形態(tài)逐漸不完整，60 h后神經元浸染多為胞體，神經元形態(tài)不完整。神經元隨著腦組織離體時間增加逐漸凋亡和消失，且神經元的消失是從末端開始的，胞體最后消失。

圖1 小鼠死亡延遲后的大腦Golgi-Cox染色及光學成像(a)小鼠死亡延遲后的大腦進行Golgi-Cox染色的示意圖，(b)高爾基染色后的腦組織光學顯微成像圖及對應神經元簡圖Fig.1 Golgi-Cox staining and light microscopy of postmortem mouse brain(a)Schematic diagram of Golgi-Cox staining of post-mortem mouse brain,(b)Light micrographs of brain tissue after Golgi staining and sketch of corresponding neurons

3.2 小鼠大腦皮層錐體神經元形態(tài)分布

樹突和軸突的形態(tài)決定了神經元如何處理和傳遞信息。多年來，Sholl analysis［18］一直被用來分析神經元的形態(tài)、樹突分支和復雜性。Sholl analysis是一種通過研究神經元的軸突和樹突形態(tài)來定量分析神經元復雜度的方法，以神經元胞體為圓心（不包括胞體）間隔相同距離作同心圓，獲得與神經元分支交點的個數(shù)，以此來反映神經元的復雜程度。為了驗證離體時間對神經元結構完整性的影響，對Golgi-Cox染色的腦組織切片中神經元的光學顯微圖像進行了Sholl analysis定量分析大腦神經元的復雜性變化（圖2（a））。通過對神經元進行Sholl analysis，量化了神經元離體后形態(tài)復雜性的變化程度，更直觀地觀察神經元形態(tài)的變化趨勢，神經元的復雜性隨著時間的增長而降低，完整性也隨之降低。

近幾十年來，老年人口不斷增加，隨之而來的是神經退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、帕金森病等）患者增多。突觸可塑性被認為是學習和記憶的基礎，在突觸重塑過程中，樹突棘的數(shù)量和形狀經歷了動態(tài)重組［19］。突觸的形成和消除對于建立神經元回路和執(zhí)行大腦功能至關重要。樹突棘大多位于中樞神經系統(tǒng)中興奮性神經傳遞的突觸后膜，通常被認為是突觸形成的標志［20］。樹突棘是位于神經元樹突上的一個突觸部位，與學習記憶密切相關。高爾基染色利用了神經元的嗜銀特性展現(xiàn)神經元和樹突棘的形態(tài)。雖然樹突棘的數(shù)量與突觸活動量并不直接相關，但樹突棘密度統(tǒng)計可用于評估突觸連接和突觸可塑性變化的過程［21］。因此，樹突棘密度統(tǒng)計在神經科學研究中被廣泛使用，人工統(tǒng)計樹突棘是很耗時的，但很準確。

通過使用蔡司光學顯微鏡對Golgi-Cox染色的腦組織切片中的樹突棘進行100×油鏡景深拍攝，獲取皮層區(qū)域的樹突棘成像。樹突棘的染色數(shù)量隨著時間的增加而減少（圖2（b）），這一趨勢與Sholl analysis一致。同時對樹突棘密度統(tǒng)計結果進行Ordinary單因素方差分析（One-way ANOVA），p＜0.000 1，證明組間差異具有統(tǒng)計學意義。

圖2 室溫下皮層區(qū)神經元Golgi-Cox染色的Sholl analysis和樹突棘密度統(tǒng)計(a)室溫下Golgi-Cox染色后的死亡延遲大腦的皮層區(qū)神經元Sholl analysis，(b)樹突棘密度統(tǒng)計（****p＜0.000 1）Fig.2 Sholl analysis and dendritic spine density statistics of Golgi-Cox staining of cortical neurons at room temperature(a)Sholl analysis of cortical neurons of post-mortem mouse brain after Golgi-Cox staining at room temperature,(b)Dendritic spine density statistics(****p＜0.000 1)

3.3 同步輻射X射線成像

圖像采集和處理時間長導致繪制大腦神經網絡連接圖譜成為一項極具挑戰(zhàn)性的工作，但是利用同步輻射X射線成像可以克服以上挑戰(zhàn)。同步輻射X射線成像具有各向同性的空間分辨率，能夠實現(xiàn)高分辨率和高通量的神經元成像，加速了全腦神經元的三維可視化，通過對小鼠大腦中的神經元進行成像驗證了這一點。實現(xiàn)全腦圖譜的構建不僅需要提高分辨率，還需要減少數(shù)據(jù)采集和處理的時間，包括兩個方面：快速圖像采集和快速圖像處理，使圖像處理的時間與原始圖像采集的時間相當。

同步輻射X射線成像利用物質密度不同產生不同的X射線吸收對比度來產生圖像襯度。未被染色的腦組織對X射線的吸收程度相似，不能產生有效的吸收對比度來實現(xiàn)神經元成像。Golgi-Cox染色液含有重金屬元素汞，被用來特異性的稀疏標記神經元以及樹突棘等精細結構且不會干擾背景，確保了適當?shù)腦射線吸收成像對比度來成像神經元及其精細結構，同時也緩解了神經元高密度染色造成的成像信噪比降低的問題，以此獲得具有高對比度和高時空分辨率的圖像。但是，每個腦組織樣品只能獲得部分神經元及其連接的圖像，因此獲取完整的神經元成像需要更多的樣品。

大腦皮層是高級神經活動的物質基礎，也是錐體神經元密集分布的地方。在本實驗中對小鼠大腦皮層區(qū)域進行了同步輻射X射線微米CT成像，用Amira軟件進行三維可視化并獲得了小鼠大腦皮層區(qū)域錐體神經元三維成像圖（圖3）。同步輻射X射線成像所獲得的結果與光鏡下所得結果相同，隨著腦組織死亡延遲時間的增長，神經元細胞隨之發(fā)生溶解，神經纖維逐漸變短直至消失。

圖3 大腦皮層區(qū)矢狀面不同時間的三維神經網絡成像Fig.3 Three-dimensional neural network imaging at different time nodes in the sagittal plane of brain cortical

3.4 尼氏染色

尼氏體作為神經元的特征結構廣泛分布于神經細胞中，可以被堿性染料染色，在光學顯微鏡下呈小顆?；驂K狀，電鏡下可觀察到粗糙的內質網和核糖體。尼氏體主要負責合成神經元正常生理活動所需的蛋白質，尼氏體的存在與消失可以判斷神經細胞是否受損。當神經元受損時，尼氏體會溶解甚至消失，數(shù)量也會明顯減少［22］。當對小鼠腦組織進行尼氏染色，尼氏染色液中的有效成分甲酚紫與RNA或DNA結合，將尼氏小體染成藍紫色。光鏡得到的實驗數(shù)據(jù)分析表明，隨著取腦間隔時間的增加，尼氏小體的數(shù)量減少并消失（圖4）。同時對其結果進行Ordinary單因素方差分析（One-way ANOVA），p＜0.000 1，證明組間差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結果表明：隨著時間的增加，神經細胞受到破壞和溶解，與Golgi-cox染色和同步輻射X射線成像的結果相吻合。同時驗證了神經元細胞特別是神經纖維隨著死亡延遲時間的增加逐漸減少甚至消失，但Golgi-Cox染色液對神經元的染色效率不會隨著細胞凋亡而降低。

圖4 死亡延遲的腦皮層區(qū)尼氏染色的光學成像及統(tǒng)計數(shù)據(jù)(****p＜0.000 1)Fig.4 Light microscopic imaging and statistical data of Nissl staining in cortical of post-mortem mouse brain(****p＜0.000 1)

4 結語

本工作用放置不同時間的鼠腦樣品來模擬死亡的人腦，探討死亡延遲時間對鼠腦高爾基染色的影響。采用光學顯微成像與同步輻射成像相結合的方法，同時獲取二維與三維的神經元形態(tài)信息進行統(tǒng)計并對比分析。實驗結果表明：放置不同時間后的鼠腦樣品，隨著時間的增長，神經元逐漸降解消失，其復雜性和完整性逐漸降低，但對Golgi-Cox染色液的吸收程度不會降低。該工作對探究人腦神經網絡的超微結構染色分析提供了新的思路，有助于更好地了解神經元的連接方式，對神經性疾病的研究也是至關重要。

作者貢獻說明燕鑫負責完成實驗的主體部分，包括Golgi-Cox染色、尼氏染色的光鏡成像和同步輻射X射線微米CT成像實驗；周峰負責小鼠隨機實驗分組和小鼠腦組織冷凍切片；湯喬偉和燕鑫負責成像數(shù)據(jù)處理和三維重構；燕鑫和蔡小青撰寫文稿；蔡小青設計和指導實驗；諸穎、王麗華、胡鈞構思文稿主體思路并全程指導文稿修改。所有作者都參與了文稿的多次討論和修改。