COL3A1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲影響的實(shí)驗(yàn)研究

姜洪偉，胡 琦*，王 舉，白鈺靈,套格蘇，李海軍，胡錦峰

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 胃腸外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特010017；2.內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗醫(yī)院 普外科；3.內(nèi)蒙古赤峰市醫(yī)院 肛腸外科)

我國(guó)胃癌(GC)發(fā)病數(shù)占全球的42.6%，死亡數(shù)占全球胃癌的45.0%,在全球所有的國(guó)家中居發(fā)病率第5位、死亡率第6位[1]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)具有多種功能——它為干細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)生態(tài)區(qū)域，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間化學(xué)和機(jī)械信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，血管生成，先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，以及細(xì)胞的遷移和侵襲[2-3]。ECM成為癌癥進(jìn)展和治療反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，能夠調(diào)節(jié)癌癥的基本特征[4]。膠原蛋白是ECM的重要組分，COL3A1基因編碼Ⅲ型膠原α-1鏈。A J d’Ardenne 等人[5]早在1984年就對(duì)不同良惡性腫瘤中COL3A1的表達(dá)進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果顯示其在所有的腫瘤標(biāo)本中均為陽(yáng)性染色；良性腫瘤中以平滑肌瘤、肌腱鞘巨細(xì)胞瘤Ⅲ型膠原表達(dá)量最高，惡性腫瘤中以平滑肌肉瘤、纖維肉瘤膠原表達(dá)量最高。Hongyu Shen等[6]利用在線生物信息軟件預(yù)測(cè)胃癌中表達(dá)上調(diào)的基因及其上游miRNAs，并進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)COL3A1在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并且可以預(yù)測(cè)胃癌的預(yù)后。本課題組前期采用實(shí)時(shí)定量PCR法(qRT-PC)及免疫組化法檢測(cè)胃癌及其正常組織中COL3A1的mRNA及蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中COL3A1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組織。本研究采用靶向COL3A1的干擾慢病毒(3個(gè)靶點(diǎn))及陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株MGC803，嘌呤霉素抗性篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，qRT-PCR法及Western blot法篩選出轉(zhuǎn)染效率高的胃癌細(xì)胞株，進(jìn)行后續(xù)MTT及Transwell實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討COL3Al在胃癌增殖、侵襲及遷移中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器MGC803 細(xì)胞(北京 Biobw，bio-81816)、青霉素-鏈霉素溶液(武漢普諾賽，PB180120)、RPMI-1640 培養(yǎng)基(武漢普諾賽，PM150110/500 ml)、0.25%胰酶(美國(guó) Hyclone，SH30042.01/100 ml)、COL3A1 基因敲除慢病毒(上海吉?jiǎng)P基因)、MTT(上海 Biosharp，5 g)、4%多聚甲醛(上海碧云天，P0099-100 ml)、1%結(jié)晶紫染色液(北京索萊寶，G1062)、Matrigel 基質(zhì)膠(美國(guó)BD Biocoat，356234)、PVDF膜(Millipore，ISEQ00010)、ECL發(fā)光液(Tanon，180-5001)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime，P0010)、熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems，ABI-7500)、微量分光光度計(jì)(美國(guó)ThermoFisher，Nanodrop 2000)、SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad，Mini Protean 3)、濕法轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，170-3930)、脫色搖床(金壇市醫(yī)療儀器，TY-80R)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Tanon，5200)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MGC803細(xì)胞在含有10%胎牛血清和100 U/ml青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 (1)嘌呤霉素濃度篩選：濃度分別為0、0.5、1、2、3、4、5 μg/ml，培養(yǎng)1周。調(diào)整濃度為5×104cells/ml后加入有促轉(zhuǎn)染劑polybrene(8 μg/ml)新鮮培養(yǎng)基，配置懸液，計(jì)算公式：病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù)目)/病毒滴度。加入嘌呤霉素后觀察熒光蛋白表達(dá)。

1.2.3qRT-PCR法 根據(jù)TAKARA PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行，提取 total RNA，3%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度,A260/A280比值在1.8-2.0之間。反轉(zhuǎn)錄后以 cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量 PCR。COL3A1引物序列：正向TTGAAGGAGGATGTTCCCATCT，反向ACAGACACATATTTGGCATGGTT。GAP

DH引物序列：正向GAGTCAACGGATTTGGTCGT，反向TTGATTTTGGAGGGATCTCG。反應(yīng)體系為cDNA 2 μl、PCR 上游引物 0.4 μl、PCR 下游引物 0.4 μl、SYBR Green solution 10 μl、滅菌雙蒸水 7.2 μl。每個(gè)樣品mRNA相對(duì)表達(dá)量通過(guò)計(jì)算其各自的Ct值計(jì)算得出。

1.2.4Western blot法 培養(yǎng)基PBS洗滌，1000轉(zhuǎn)離心 5 min，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104cells/ml。接種于培養(yǎng)板培育48 h。PBS洗滌后，0.2 ml/孔加入裂解液，置入-80℃超低溫冰箱中。離心后留下細(xì)胞上清液，-20℃下保存。配置BCA工作液：按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl的濃度量加入96孔中。加入BCA工作液孵育。測(cè)定吸光度值。清洗玻璃板后灌膠，80V電泳30 min，樣品進(jìn)入分離膠后，改120V電泳90 min。電流320 mA開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用1×麗春紅染液染膜5 min。浸泡TBS后,轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉、TBST溶液的平皿中,脫色搖床封閉。TBST稀釋一抗，4℃孵育，脫色搖床清洗10 min，重復(fù)3次。二抗的孵育首先使用TBST溶液1∶5000稀釋，然后孵育2h，脫色三次。用Tanon ECL作為發(fā)光試劑，Tanon 5200化學(xué)發(fā)光成像儀拍照，留下拍照后圖片。

1.2.5MTT實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)基終止消化后離心5 min。倒掉上清，加入3 ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。胰酶消化細(xì)胞，離心后去上清，重懸細(xì)胞。細(xì)胞接種在6孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，接種后培養(yǎng)12 h貼壁。敲減COL3A1處理下，細(xì)胞培養(yǎng)至設(shè)定時(shí)間(0、12、24、48 h)后，每孔分別加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h后去除，加入150 μl DMSO搖勻。吸光值用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，波長(zhǎng)570 nm，根據(jù)吸光值和時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) PBS洗滌后胰酶消化，放入新培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。10% FBS的培養(yǎng)液加入孔板，使細(xì)胞濃度為(5×105/ml)，Transwell小室加入100 μl 懸液并放培養(yǎng)24 h。取出小室，吸凈培養(yǎng)液后清理掉上層細(xì)胞，PBS洗滌，甲醇固定。PBS洗滌三次，擦干后使用1%結(jié)晶紫染液染色后PBS清洗3次，常溫倒置晾干。顯微鏡下(200倍)拍照并計(jì)算各視野中穿膜細(xì)胞的平均數(shù)。

1.2.7細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將無(wú)血清培養(yǎng)基與預(yù)冷的Matrigel基質(zhì)膠9∶1混勻。

將上步Matrigel基質(zhì)膠100 μl加入Transwell小室，然后放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，等待基質(zhì)膠凝固。其余實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，數(shù)據(jù)處理軟件為GraphPad Prism 6，兩組樣本均值之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本均值之間的比較采用ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)MGC803胃癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)正常的MGC803細(xì)胞多為梭形或多角形，也有部分為圓形。呈單核、單層貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)(圖1)。

圖1 光鏡下 MGC803 細(xì)胞形態(tài)觀察(200 倍)

2.2 MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染

靶向COL3A1的干擾慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)COL3A1 shRNA慢病毒成功轉(zhuǎn)染到MGC803細(xì)胞內(nèi)(圖2)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的干擾組及對(duì)照組細(xì)胞株分別分為陰性對(duì)照組(NC組)、shRNA 1組、shRNA 2組和shRNA 3組，未轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞株為空白對(duì)照組(Control組)。

圖2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光攜帶情況

用qRT-PCR和Western blot法篩選出轉(zhuǎn)染效率最高的細(xì)胞株，qRT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染shRNA-COL3A1慢病毒后，COL3A1的mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)；與NC組相比，COL3A1在shRNA 1組、shRNA 2組、shRNA 3組的mRNA表達(dá)同樣顯著下降，而NC組與Control組相比細(xì)胞的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，在這三組中抑制效果最好的是shRNA 1組(P<0.01)、shRNA 3組(P<0.001)(圖3)。選擇shRNA 1組和shRNA 3組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中shRNA 1組及shRNA 2組為該步中的shRNA 1組和shRNA 3組。重新分組后進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后,胃癌細(xì)胞中COL3A1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，其中shRNA 2組抑制效果更顯著(P<0.01)(圖4)，這與PCR的結(jié)果一致。

圖3 shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后COL3A1 mRNA表達(dá)水平(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs.Control；##P<0.01，### P<0.001vs.NC)

A：WB曝光條帶；B：COL3A1的蛋白表達(dá)水平

2.3 MGC803 MTT

轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖能力通過(guò)MTT法檢測(cè)(表1)，通過(guò)繪制不同時(shí)間點(diǎn)的光吸收值得到生長(zhǎng)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后，胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)在48 h內(nèi)受到明顯抑制，在各時(shí)間點(diǎn)OD值均低于NC組(P<0.05)，其中shRNA 2組抑制效果最為顯著(P<0.0001)(圖5)。

表1 敲減COL3A1后各組MGC803細(xì)胞平均吸光值(OD值：Mean±SD)

圖5 shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后48 h內(nèi)胃癌細(xì)胞增殖情況 (*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001 vs NC，n=3)

2.4 MGC803細(xì)胞遷徙

通過(guò)Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，計(jì)數(shù)膜下細(xì)胞數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-COL3A1轉(zhuǎn)染后，shRNA 1組(P=0.0029)及shRNA 2組(P<0.0001)胃癌細(xì)胞的遷移能力顯著降低，其中以shRNA 2組最為顯著(P<0.0001)(圖6)。

A：顯微鏡下穿膜細(xì)胞觀察(200 倍)；B：各組穿膜細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.5 MGC803細(xì)胞侵襲

通過(guò)Transwell小室(加Matrigel基質(zhì)膠)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)shRNA-COL3A1 轉(zhuǎn)染后，shRNA 1組(P=0.0046)及shRNA 2組(P=0.0002)胃癌細(xì)胞的侵襲能力均顯著降低，其中同樣以shRNA 2組最為顯著(P<0.001)(圖7)。

A：顯微鏡下穿膜細(xì)胞觀察(200倍)；B：各組穿膜細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，為了進(jìn)一步探究COL3A1與胃癌的關(guān)系，本研究通過(guò)COL3A1敲減的慢病毒轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株BGC-803，并檢測(cè)經(jīng)處理后胃癌細(xì)胞的遷徙及侵襲能力，結(jié)果顯示敲減COL3Al能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，說(shuō)明COL3Al可能是胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要角色。推測(cè)這是由于COL3A1表達(dá)降低后胃癌細(xì)胞周圍膠原網(wǎng)絡(luò)剛度下降所致。細(xì)胞外基質(zhì)硬化導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)收縮可引起肌動(dòng)蛋白硬度和細(xì)胞遷移增加[7]。腫瘤硬度增加可能在幾個(gè)方面調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。例如增加基質(zhì)剛度會(huì)增加細(xì)胞骨架張力，以促進(jìn)粘連聚集，并增加生長(zhǎng)因子依賴性的胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)[8]。此外，基質(zhì)剛度促進(jìn)整合素聚類，導(dǎo)致黏著斑激酶1(FAK1)的激活，進(jìn)而激活ERK通路，引起細(xì)胞遷移、侵襲和增殖[9]。小鼠腫瘤模型中FAK1的缺失抑制了腫瘤細(xì)胞的局部侵襲和轉(zhuǎn)移，這表明FAK1的激活可能是引起腫瘤ECM剛度增加、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)[10]。王頡[11]等發(fā)現(xiàn)COL3A1可以通過(guò)蛋白激酶B(PKB) /哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路發(fā)揮促結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)的作用。Wang Xiao-Qing[12]等同樣發(fā)現(xiàn)COL3A1在結(jié)直腸癌中存在過(guò)表達(dá)，并且是影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，COL3A1還可以通過(guò)刺激磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-AKT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。Becky[13]等學(xué)者通過(guò)體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)COL3A1缺乏后，乳腺癌的黏附、侵襲和遷移均被抑制，癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。而艾爾肯·肉孜比拉力[14]等的研究結(jié)果則不同，她們發(fā)現(xiàn)COL3A1在宮頸癌中為低表達(dá)，且人乳頭狀瘤病毒(HPV)陰性的宮頸癌細(xì)胞COL3A1的表達(dá)水平更高，過(guò)表達(dá)COL3A1后的宮頸癌細(xì)胞遷徙能力下降，這提示 COL3A1 在不同腫瘤中可能存在不同的功能。引起這種不同結(jié)果的原因可能是ECM與腫瘤細(xì)胞間復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化所致。

綜上所述，COL3A1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，這為探究微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用提供了新的思路。但是COL3A1與胃癌的關(guān)系還是有待進(jìn)一步的深入研究。本研究因客觀原因仍存在很多不足，如未檢測(cè)COL3A1在不同胃癌細(xì)胞系中的基礎(chǔ)表達(dá)情況，也未構(gòu)建COL3A1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系對(duì)其在胃癌增殖、轉(zhuǎn)移中的作用進(jìn)一步作證，這也是我們下一步的研究方向。