不同水解方式下蠶絲絲素蛋白材料的止血性能

雷彩虹， 俞林雙， 朱海霖， 鄭 濤， 陳建勇

(1. 浙江理工大學 紡織科學與工程學院(國際絲綢學院)， 浙江 杭州 310018； 2. 浙江省纖維材料和加工技術(shù)研究重點實驗室， 浙江 杭州 310018)

利用止血材料進行止血處理是醫(yī)療救治的重要方法。長期以來，較為廣泛使用的止血材料有無機沸石類、明膠類、氧化纖維素類、殼聚糖類等。盡管這些材料均顯現(xiàn)出良好的止血效果，然而卻存在有毒副作用、容易引起感染、成本及售價高等問題[1-2]。蠶絲是一種純天然的動物蛋白質(zhì)纖維，主要成分是絲素蛋白，具有可靠的生物安全性、良好的生物降解性、易加工成形等特性[3-4]，將蠶絲纖維應(yīng)用于生物止血材料[5]的研究引起了人們的關(guān)注。

近年來，國內(nèi)外研究者以蠶絲絲素蛋白作為原材料，通過不同制備方法獲得各種蠶絲絲素蛋白止血材料，主要是分析某一種水解方式獲得的蠶絲絲素蛋白材料的止血性能。如Chen等[6]采用 9.3 mol/L 溴化鋰水解蠶絲絲素蛋白，研究絲素蛋白材料的體外止血活性；Huang等[7]基于氯化鈣/乙醇/水(量比為1∶2∶8)水解蠶絲絲素蛋白，探討改性絲素蛋白材料的止血性能。采用不同制備方法制得的蠶絲絲素蛋白材料具有不同的止血性能，但關(guān)于絲素蛋白水解方式與止血性能之間的相關(guān)性研究較少。

為此，本文采用氯化鈣/乙醇/水溶液、堿性蛋白酶2種常用的水解方式水解蠶絲絲素蛋白，通過冷凍干燥法制備獲得2種蠶絲絲素蛋白材料，采用凝血因子實驗、血小板黏附實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗、大鼠肝部出血實驗等對其止血性能進行研究，以期為絲素蛋白止血材料的制備和應(yīng)用提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：蠶繭(購自浙江省桐鄉(xiāng)市)；無水氯化鈣、無水乙醇、枸櫞酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；硼酸鹽緩沖溶液(上?？道噬锟萍加邢薰?；堿性蛋白酶(1.5×105U/mL，美國Sigma-Aldrich公司)；透析袋(截留分子質(zhì)量為8 000 u)、維生素B12(1 300 u)、抑肽酶(2 500 u)、胰凝乳蛋白酶(25 000 u)、卵清蛋白(45 000 u)和牛血清蛋白(67 000 u)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；新西蘭大白兔、健康雌雄不限成年SD大鼠，質(zhì)量約為260 g(均由杭州師范大學實驗動物中心提供)；云南白藥(云南白藥集團股份有限公司)。

儀器：CP214型電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；超低溫冰箱(上海比朗儀器有限公司)；Labconco FreeZone?4.5L真空冷凍干燥機(美國Labconco公司)；CA7000型全自動凝血分析儀(日本希森美康公司)；TEK8510型五分類血液分析儀(江西特康科技有限公司)；Victor X型酶標儀(美國Perkin-Elmer 公司)；Agilent 1100型高壓液相色譜儀(美國Agilent Technologies 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶絲絲素蛋白材料的制備

脫膠蠶絲的制備：將一定量除去蠶蛹的蠶繭繭殼，加入至5 g/L碳酸鈉溶液中，于98 ℃加熱，重復(fù)脫膠2次(每次60 min)后清洗烘干，制得脫膠蠶絲。

鹽解蠶絲絲素蛋白材料的制備：將上述制得的脫膠蠶絲按1∶10浴比溶于氯化鈣/乙醇/水(量比為1∶2∶8)溶液中，于90 ℃反應(yīng)3 h，冷卻后將溶液抽濾，濾液灌入透析袋密封，經(jīng)去離子水透析72 h后倒入聚苯乙烯培養(yǎng)皿中，于-80 ℃冷凍12 h，冷凍結(jié)束后再真空冷凍干燥72 h，得到鹽解蠶絲絲素蛋白材料，標記為SF-A，真空袋保存?zhèn)溆谩?/p>

酶解蠶絲絲素蛋白材料的制備：參考文獻[8]稱取一定量上述制備的鹽解蠶絲絲素蛋白作為底物，設(shè)置底物的質(zhì)量分數(shù)為5%，酶的用量按底物質(zhì)量的2%添加，用0.5 mol/L pH值為8.5的硼酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)水解液的pH值為8.5，加入堿性蛋白酶在55 ℃反應(yīng)2 h，反應(yīng)后迅速升溫至100 ℃將酶失活；然后將冷卻后獲得的溶液于15 000 r/min離心15 min， 用超濾膜(孔徑為0.22 μm)過濾除去酶蛋白及沉淀物，再將濾液倒入聚苯乙烯培養(yǎng)皿中，于-80 ℃冷凍12 h，冷凍結(jié)束后真空冷凍干燥72 h，得到酶解蠶絲絲素蛋白材料，標記為SF-B，真空袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分子質(zhì)量測試

參考文獻[9]采用凝膠過濾色譜法，用高壓液相色譜儀測試表征2種不同水解方式制備的蠶絲絲素蛋白的分子質(zhì)量。測試條件：選取Protein KW-802.5型色譜柱；選用磷酸鹽緩沖溶液(100 mmol/L， pH值為6.8)為洗脫液，洗脫速度為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；檢測波長為215 nm。 用于擬合標準曲線的分子質(zhì)量標準樣品為：維生素B12、 抑肽酶、胰凝乳蛋白酶、卵清蛋白和牛血清蛋白。以保留時間(t)和分子質(zhì)量的自然對數(shù)值(lnM)擬合得到標準曲線lnM=18.138-0.445t(R=0.997 8)，根據(jù)標準曲線計算蠶絲絲素蛋白的分子質(zhì)量。

1.2.3 水溶性測試

稱取一定量的干燥蠶絲絲素蛋白材料樣品(m1， mg) 放入去離子水中，置于恒溫磁力攪拌器上(30 min) 攪拌后過濾，烘至恒態(tài)質(zhì)量，稱量記為m2(mg)，每個試樣測試6次取平均值。溶解率(W)計算公式為

W=(m1-m2)/m1×100%

1.2.4 凝血時間測試

在止血過程中，凝血因子的激活和血小板的黏附、活化對促進血液凝固有著重要的作用。采用活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)考察蠶絲絲素蛋白材料對凝血因子的宏觀影響。將抗凝兔血(血液與3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑體積比為 9∶1) 離心(37 ℃、3 000 r/min)制備得到貧血小板血漿。按文獻[10]將貧血小板血漿與0.05 mL氯化鈣溶液(0.025 mol/L)和樣品(1 mg/mL)混勻后，迅速采用全自動凝血分析儀測量此時的APTT和PT值，每個試樣測試6次取平均值，未加入材料的空白組作為空白對照樣。

1.2.5 血小板黏附測試

采用血小板黏附實驗表征蠶絲絲素蛋白材料對血小板的黏附作用。將1.8 mL抗凝兔血與100 mg樣品(云南白藥為對照樣品)充分混合，水浴恒溫(37 ℃、 10 min)后離心(1 500 r/min、20 min)，采用五分類血液分析儀測試血小板數(shù)，每個試樣測試 6次取平均值。 血小板黏附率計算公式為

N=(n1-n2)/n1×100%

式中：N為血小板黏附率，%；n1為空白組血小板數(shù)，個/mL；n2為加材料組血小板數(shù)，個/mL。做空白對照實驗時不加任何物質(zhì)，其他條件一致。

1.2.6 血小板第4因子測試

采用血小板第4因子(PF4)表征蠶絲絲素蛋白材料對血小板活化程度的影響。按文獻[11]采用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定，PF4含量用吸光度值的變化表征。將1.8 mL抗凝鼠血與0.2 mL 1 mg/mL樣品(云南白藥為對照樣品)混合，于37 ℃恒溫孵育15 min后，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液為待測血漿。采用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，每個試樣測試6次，取平均值。

1.2.7 體內(nèi)止血效果測試

通過大鼠肝部出血實驗評價蠶絲絲素蛋白材料的止血效果。大鼠肝部出血實驗參考文獻[12]：將SD大鼠隨機分成3組，每組6只。將麻醉后的SD大鼠沿腹中線剪一切口，使肝部中葉充分暴露，吸干肝臟周圍組織液，在肝部中葉遠端作1 cm的切口，血液涌出后立即將80 mg樣品(云南白藥為對照樣品)貼敷于創(chuàng)口表面，觀察并記錄出血時間和出血量，每個試樣測試6次，取平均值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 分子質(zhì)量和水溶性分析

2種蠶絲絲素蛋白的分子質(zhì)量根據(jù)標準曲線lnM=18.138-0.445t計算得到：由氯化鈣/乙醇/水三元體系水解制備的蠶絲絲素蛋白的分子質(zhì)量主要分布在4 700～20 700 u之間，由堿性蛋白酶水解制備的蠶絲絲素蛋白分子質(zhì)量主要分布在400～10 400 u 之間，其中分子質(zhì)量小于10 000 u的組分含量很高，且存在分子質(zhì)量分布范圍為400～5 000 u的低分子質(zhì)量組分。水溶性測試結(jié)果表明，與鹽解蠶絲絲素蛋白材料SF-A的水溶性((79.34±2.80)%)相比，酶解蠶絲絲素蛋白材料SF-B的水溶性(97.10±1.87)%)明顯提高，這歸因于利用堿性蛋白酶分解絲素蛋白時，能作用于較寬范圍的肽鍵更大程度地促進了絲素水解，得到了水溶性較好的小分子絲素蛋白[8]。

2.2 凝血時間分析

圖1示出2種水解方式制備的蠶絲絲素蛋白材料的APTT和PT值。與空白樣相比，由不同水解方式獲得的絲素蛋白材料SF-A和SF-B的APTT均顯著縮短。從PT可知，2種蠶絲絲素蛋白材料的凝血時間相對于空白樣均無顯著性差異。表明其凝血作用與縮短APTT有關(guān)，與縮短PT無關(guān)。這也說明采用這2種水解方式制得的蠶絲絲素蛋白材料均能夠通過激活凝血因子Ⅻ[13]，啟動內(nèi)源性凝血途徑來促進血液凝固[14]。由圖1還可見，酶解蠶絲絲素蛋白材料SF-B的APTT最短。由水溶性測試結(jié)果可知，SF-B的水溶性較好，更易通過液相激活促進凝血因子Ⅻ活化[15]。由此推測蠶絲絲素蛋白材料的APTT與水解方式有關(guān)，水解蠶絲絲素蛋白時采用堿性蛋白酶比氯化鈣/乙醇/水三元鹽水解體系更易縮短APTT。

圖1 采用2種水解方式制備的蠶絲絲素蛋白 材料的APTT與PT值Fig.1 APTT and PT values for two different hydrolysis systems of silk fibroin materials

2.3 血小板黏附分析

由血小板黏附率實驗測得2種蠶絲絲素蛋白材料SF-A、SF-B的黏附率分別為(24.85±5.68)%和(53.96±6.04)%。 可見，2種蠶絲絲素蛋白材料對血小板均有一定的黏附，均能誘導(dǎo)血小板黏附。其中，SF-B與對照樣(黏附率為(44.21±3.13)%)相比，具有統(tǒng)計學上的顯著性差異(P<0.01)。血小板黏附率測試結(jié)果還表明，采用2種水解方式獲得的蠶絲絲素蛋白材料黏附血小板的能力不同，其中SF-B對血小板的黏附量高于SF-A，由此推測水溶性較好的酶解蠶絲絲素蛋白材料SF-B與血液接觸時，有可能易形成較強的負電性表面，更好地促進誘導(dǎo)血小板黏附[11]，這需做進一步研究。

2.4 血小板第4因子分析

PF4是血小板在蛋白材料表面接觸刺激下，被激活后合成釋放到血液中的活性物質(zhì)，能促進血栓的形成，是血小板活化的重要指標[16]。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定時，吸光度值的變化與PF4含量呈正相關(guān)。圖2示出采用2種水解方式制備的蠶絲絲素蛋白材料的吸光度。可以看出，采用2種水解方式制備的蠶絲絲素蛋白材料的吸光度不同，且明顯比空白樣高，進一步分析可知，2種蠶絲絲素蛋白材料均可促進PF4的生成，這意味著2種材料均對血小板具有活化作用，血小板激活后釋放活性物質(zhì)PF4，從而促進血小板血栓的形成達到凝血。從圖2還可知，酶解蠶絲絲素蛋白材料SF-B使PF4的含量顯著增加，說明酶解蠶絲絲素蛋白材料更能促進PF4的生成，對血小板有較強的激活作用，這與上述血小板黏附的討論結(jié)果一致。綜上可知，蠶絲絲素蛋白材料參與止血反應(yīng)與誘導(dǎo)血小板的黏附和激活有關(guān)[7,17]。

圖2 2種水解方式下制備的蠶絲絲素蛋白 材料的吸光度Fig.2 Absorbance value of silk fibroin materials produced by two different hydrolysis systems

2.5 體內(nèi)止血效果分析

圖3示出采用2種水解方式制備的蠶絲絲素蛋白材料肝部出血時間和出血量?？梢钥闯觯c空白樣相比，當2種水解方式制備的蠶絲絲素蛋白材料作用于大鼠肝部創(chuàng)傷表面上時，出血時間迅速縮短，出血量顯著減少。其中酶解蠶絲絲素蛋白材料SF-B的出血時間短，出血量少，優(yōu)于云南白藥對照樣(P<0.01)，因此，具有較好的止血效果。綜合前文分析推測，蠶絲絲素蛋白材料的止血性能與水解絲素蛋白方式有關(guān)，采用酶法比鹽法更能提高其止血性能。

圖3 2種水解方式下制備的蠶絲絲素蛋白 材料肝部出血時間和出血量Fig.3 Hemostatic time and amount of bleeding for silk fibroin materials produced by two different hydrolysis systems in liver trauma model

3 結(jié) 論

本文采用氯化鈣/乙醇/水溶液鹽解法和堿性蛋白酶酶解法水解蠶絲絲素蛋白，制得了2種蠶絲絲素蛋白材料，通過研究材料的分子質(zhì)量、水溶性和止血效果，探究了水解方式對蠶絲絲素蛋白材料止血性能的影響，得出如下主要結(jié)論。

1)采用鹽解和酶解2種不同水解方式制備的材料均通過激活凝血因子Ⅻ，啟動引起血液凝固的內(nèi)源性途徑，并通過黏附、活化血小板促進血小板血栓的形成而止血。

2)凝血因子、血小板等指標與蠶絲絲素蛋白材料制備過程中的水解方式密切相關(guān)，采用堿性蛋白酶制備的絲素蛋白分子質(zhì)量較低、水溶性較好，有利于激活凝血因子Ⅻ，更能對內(nèi)源性凝血途徑起促進作用，對血小板的黏附量增加，使血小板第4因子PF4的含量增加，止血性能增強。

3)用堿性蛋白酶水解蠶絲絲素蛋白制得的材料的出血時間短，出血量少，止血效果優(yōu)于云南白藥。