養(yǎng)血復(fù)春丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

何宇霞 荊 然 吳鑫平 郝旭亮 花 卉 林建翠 吳 瓊

（1.山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西 太原 030012；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院辦，山西 太原 030024；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 太原 030619）

養(yǎng)血復(fù)春丸是山西省中醫(yī)院名老中醫(yī)的臨床驗(yàn)方，由熟地黃、當(dāng)歸、川芎、女貞子、黃芪、淫羊藿等33味中藥組成，具有養(yǎng)血添精，健脾益氣、疏肝怡神、調(diào)補(bǔ)五臟等功效。養(yǎng)血復(fù)春丸通過(guò)重用補(bǔ)腎填精藥物，溫煦胞宮、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，在緩解宮寒的同時(shí)，也可達(dá)到明顯的助孕備孕效果，各味中藥材之間藥效相互補(bǔ)充、互相配合、揚(yáng)長(zhǎng)避短，從身體全方位調(diào)理，體現(xiàn)了中醫(yī)整體治療的中心指導(dǎo)原則。

養(yǎng)血復(fù)春丸有著養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，培補(bǔ)精氣，舒肝怡神，暖宮助孕的作用，適用于月經(jīng)不調(diào)、量少或閉經(jīng)、陰道干澀、性欲低下、腰膝酸軟、面黯神憔屬精血虧損癥，亦可用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之卵巢早衰、子宮內(nèi)膜損傷、需備孕助孕者。經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用，已成為療效確切的驗(yàn)方。養(yǎng)血復(fù)春丸藥物組成復(fù)雜，制作工藝繁瑣，并且目前缺少定性及定量的質(zhì)控指標(biāo)，缺少多指標(biāo)的綜合性的試驗(yàn)方法。鑒于此，為更好地控制醫(yī)院制劑的質(zhì)量，本研究對(duì)養(yǎng)血復(fù)春丸開展了較為系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)研究工作，對(duì)益母草、五味子、砂仁、甘草、陳皮、菟絲子、牡蠣、珍珠母進(jìn)行顯微鑒別，對(duì)黃芪、三七、當(dāng)歸、川芎進(jìn)行薄層鑒別。選芍藥苷用HPLC作為含量測(cè)定的指標(biāo)，建立了芍藥苷的含量測(cè)定方法及含量限度，為有效控制養(yǎng)血復(fù)春丸的質(zhì)量提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 多功能紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；顯色加熱器（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司）；電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；200 克萬(wàn)能粉碎機(jī)（西安比朗生物科技有限公司）；LC-300B型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（山東濟(jì)寧魯超超聲設(shè)備有限公司）；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；戴安U3000 高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；BX51-DP72 萬(wàn)能熒光成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）。

1.2 試劑 薄層硅膠G板（青島海浪硅膠干燥劑廠），乙腈為色譜純（20180106，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 對(duì)照藥材、對(duì)照品及樣品 三七對(duì)照藥材（批號(hào)：130911-201531），川芎對(duì)照藥材（批號(hào)：131105-201014），當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)：131082-201371），所用藥材均由山西省中醫(yī)院提供。養(yǎng)血復(fù)春丸陰性樣品為自制。黃芪甲苷（批號(hào)：110781-200613）、芍藥苷（批號(hào)：0737-200111），標(biāo)準(zhǔn)品均由中國(guó)食品藥品檢定研究所提供。養(yǎng)血復(fù)春丸供試品3 批（20191101、20191102、20191103）由山西省中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取養(yǎng)血復(fù)春丸內(nèi)容物適量，研細(xì)，置于載玻片上，滴加水合氯醛試液1～2 滴，攪拌均勻，加熱透化后將載玻片從一側(cè)輕輕放下，用濾紙吸除溢出的液體，置于顯微成像系統(tǒng)的顯微鏡載物臺(tái)上，10倍鏡下觀察，必要時(shí)調(diào)至40 倍高倍鏡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：益母草顯微特征為非腺毛1～3 細(xì)胞，稍彎曲，壁有疣狀突起[1]（見圖1A）。五味子顯微特征為種皮石細(xì)胞呈淡黃色或淡黃棕色，表面觀呈多角形，壁較厚，孔溝細(xì)密，胞腔含深棕色物[2]（見圖1B）。砂仁顯微特征為內(nèi)種皮厚壁細(xì)胞黃棕色或棕紅色，表面觀類多角形，壁厚，胞腔含硅質(zhì)塊[3]（見圖1C）；甘草顯微特征為纖維束周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶鞘纖維（見圖1D）。陳皮顯微特征為草酸鈣方晶成片存在于薄壁組織中（見圖1E）。菟絲子顯微特征為種皮柵狀細(xì)胞2 列，內(nèi)列較外列長(zhǎng)，有光輝帶[4]（見圖1F）。牡蠣顯微特征為不規(guī)則塊片無(wú)色或淡黃褐色，表面具細(xì)紋理[1，5]（見圖1G）。珍珠母顯微特征為不規(guī)則碎塊表面多不平整，呈明顯的顆粒性，有的呈層狀結(jié)構(gòu)，邊緣多數(shù)為不規(guī)則鋸齒狀[6]（見圖1H）。

圖1 顯微鑒別

2.2 薄層色譜法鑒別

2.2.1 黃芪薄層鑒別 取本品20 g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，加甲醇60 mL，加熱水浴回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL 使溶解，用水飽和正丁醇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次25 mL，正丁醇液再用正丁醇飽和水洗滌2次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg 的溶液（2 mg/mL），作為對(duì)照品溶液。按處方自制不含黃芪的陰性制劑，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性溶液各5 μ L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視[1，7]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖2、圖3。

2.2.2 三七薄層鑒別 取本品20 g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用0.5%氫氧化鈉溶液洗滌2 次，每次10 mL，棄去堿液，再用水洗滌2 次，每次20 mL，棄去水洗液，正丁醇液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状糽 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取三七對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方自制不含三七的陰性制劑，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性溶液各5 μ L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃ 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視[1，8]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點(diǎn)，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見圖4、圖5。

圖4 三七的薄層鑒別圖譜TLC 彩圖

圖5 三七的薄層鑒別紫外TLC 彩圖

2.2.3 當(dāng)歸川芎薄層鑒別 取本品10 g，研細(xì)，加硅藻土10 g，研勻，加乙酸乙酯60 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材、川芎對(duì)照藥材各0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方自制不含當(dāng)歸、川芎的陰性制劑，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性溶液各5 μ L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[1，9]。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖6。

圖6 川芎、當(dāng)歸的薄層鑒別圖譜

2.3 芍藥苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；DAD檢測(cè)器檢測(cè)；流動(dòng)相為乙腈-水（13∶87），流速：1.0 mL/mi n，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μ L，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000[10]。

2.3.2 溶液制備 （1）對(duì)照溶液的制備。精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.0533 mg 的溶液。（2）供試品溶液的制備。取裝量差異下的本品5 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理（150 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，濾過(guò)，濾液，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性對(duì)照溶液的制備。按處方自制不含炒白芍的陰性制劑，照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 分別精確吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照液各10 μ L，注入液相儀，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，陰性對(duì)照對(duì)供試品中黃芩苷的檢測(cè)無(wú)干擾，見圖7。

圖7 高效液相色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考查 分別吸取濃度為0.0533 mg/mL 的芍藥苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、12、15 μ L，注入高效液相色譜儀，按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算峰面積，結(jié)果見表1。以芍藥苷濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y＝283.9X+0.2634，r ＝0.9998。結(jié)果表明，芍藥苷在0.0533～0.7995 μ g 范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量具有良好的線性關(guān)系。

表1 芍藥苷含量與峰面積線性關(guān)系表

2.3.5 重復(fù)性考察 取同一批樣品（批號(hào)：20191102）適量，研細(xì)，取5 g，精密稱定，共6 份，分別按照“2.3.2”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定峰面積，計(jì)算芍藥苷含量，結(jié)果表明：同一批樣品中芍藥苷含量的RSD為2.63%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.6 回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20191102）2.5 g，精密稱定，共6 份，分別精密添加一定量的對(duì)照品，按照“2.3.2”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣10 μ L，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果表明：六次實(shí)驗(yàn)的加樣回收率測(cè)定結(jié)果均在93%～100%之間，芍藥苷平均回收率為96.13%，RSD為2.45%，說(shuō)明該方法測(cè)定芍藥苷的含量準(zhǔn)確性良好。

2.3.7 含量限度的確定 三批樣品中芍藥苷含量分別為2.45 mg/ 袋、2.28 mg/ 袋、2.12 mg/ 袋，養(yǎng)血復(fù)春丸的規(guī)格為每袋裝6 g（相當(dāng)于飲片4.2 g），結(jié)合藥典規(guī)定炒白芍飲片中含芍藥苷（C23H28O11）的限量（不少于1.2%），以及本品中芍藥苷的轉(zhuǎn)移率，考慮到不同批次藥材質(zhì)量存在差異及本品裝量差異，暫定本品每袋含芍藥苷不得低于2 mg。

3 討論

在當(dāng)歸、川芎的薄層鑒別實(shí)驗(yàn)中，筆者根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版所使用的方法分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，但是陰性有強(qiáng)干擾，重復(fù)點(diǎn)樣均無(wú)改善。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[9，11]，當(dāng)歸、川芎易互相干擾，在同一方中出現(xiàn)時(shí)經(jīng)常用雙陰性進(jìn)行定性檢測(cè)，所以以正己烷-乙酸乙酯（5∶1）為展開劑進(jìn)行雙陰性檢測(cè)，展開后特征斑點(diǎn)清晰易觀察，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，陰性未見干擾，薄層結(jié)果理想。

本實(shí)驗(yàn)曾嘗試對(duì)養(yǎng)血復(fù)春丸中的巴戟天、山萸肉、菟絲子、益母草等藥材建立起相應(yīng)的薄層鑒別方法，但是這些薄層結(jié)果均不理想，表現(xiàn)為分離度差、藥物特征斑點(diǎn)重合等現(xiàn)象。推測(cè)原因可能是本處方藥味多，藥量大，取樣量少容易導(dǎo)致樣品中含有所測(cè)定藥品量太少，易出現(xiàn)干擾；但提高取樣量后，處方本身藥量大會(huì)引起干擾成分增多，從而導(dǎo)致薄層板上分離度差，藥物特征斑點(diǎn)重合，難以辨別。因此養(yǎng)血復(fù)春丸中其他藥材的薄層鑒別方法，是今后研究工作需要進(jìn)一步完善的地方。

在顯微鑒別中，通過(guò)選取顯微特征明顯的八種藥材完善了養(yǎng)血復(fù)春丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。綜上，對(duì)益母草、五味子、砂仁、甘草、陳皮、菟絲子、牡蠣、珍珠母建立起顯微鑒別方法；對(duì)黃芪、三七、當(dāng)歸、川芎建立起薄層色譜鑒別方法；對(duì)炒白芍含量測(cè)定建立起HPLC法，陰性無(wú)干擾，方法操作簡(jiǎn)便穩(wěn)定可靠，為養(yǎng)血復(fù)春丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定奠定了良好的理論基礎(chǔ)。