重樓生化湯中藥配方顆粒急性毒性實(shí)驗(yàn)*

駱紅飛 汪雪峰 江延姣

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005

我院臨床應(yīng)用自擬重樓生化湯防治剖宮產(chǎn)術(shù)后惡露不絕已取得較好的療效[1,2]。本研究通過(guò)重樓生化湯配方顆粒急性毒性實(shí)驗(yàn)，初步評(píng)價(jià)重樓生化湯配方顆粒的口服用藥安全性，為重樓生化湯配方顆粒的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物：ICR小鼠，SPF級(jí)，60只，雌雄各半，體質(zhì)量21～25g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，質(zhì)量合格證號(hào)：20180006012877、20180006013106，SPF級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22±2℃，相對(duì)濕度40%～70%，使用許可證號(hào)：SYXK(浙)2018-0012。分籠飼養(yǎng)，自由攝食進(jìn)水，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑：重樓生化湯處方組成：重樓、桃仁、黃芪各 10g,當(dāng)歸 20g，川芎 12g，炮姜 6g，益母草30g，炙甘草3g。重樓生化湯中藥配方顆粒由浙江惠松制藥有限公司提供，每袋顆粒劑重8.7g，每劑17.4g。谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號(hào)：191116101）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號(hào)：190920101）、尿素氮（BUN）試 劑 盒（批號(hào)：191211101）、肌酐（Cr）試劑盒（批號(hào)：190925201），上述試劑盒均購(gòu)自美康生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備：電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，型號(hào)：TJ3K型；高速冷凍離心機(jī)：BECKMAN COULTER，型號(hào)：X-15R型；超低溫冰箱：Thermo Fisher Scientific，型號(hào)：994型；全自動(dòng)生化分析儀：日立3100型；梅特勒分析天平：XS205DU型；移液器：德國(guó)，eppendorf。

2 方法

2.1 藥物配置：重樓生化湯中藥配方顆粒每袋重8.7g，取重樓生化湯配方顆粒劑倒入干凈燒杯中，再加入超純水，用勻漿器攪拌勻漿使其分散均勻并溶解，再加入1袋上述顆粒劑并加入少許超純水重復(fù)攪拌并勻漿，直至藥物溶解并分散均勻，以小鼠灌胃針能順利通過(guò)為度，最終加入7袋上述顆粒劑定容至80ml體積，濃度為0.76g·ml-1。

2.2 小鼠半數(shù)致死量（LD50）預(yù)實(shí)驗(yàn)：ICR小鼠20只，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前1d禁食不禁水12h。24h內(nèi)按最大給藥量（MAD，給藥體積0.4ml/10g）3次給予小鼠0.76g·ml-1中藥顆粒劑樣品，連續(xù)觀察24h，并記錄小鼠死亡數(shù)。

2.3 急性毒性MAD法實(shí)驗(yàn)：ICR小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分為三組：空白組、溶媒組和給藥組，每組20只，雌雄各半，開始實(shí)驗(yàn)前1d均禁食不禁水12h。給藥組以0.76g·ml-1重樓生化湯配方顆粒按小鼠灌胃MAD（給藥體積0.4ml/10g），24h內(nèi)分3次灌胃給藥，每次間隔6h，溶媒組同時(shí)灌服相同給液體積超純水，空白組不給予任何處理。連續(xù)觀察14d，每天觀察記錄小鼠外觀、行為表現(xiàn)、飲食、分泌物、排泄物、中毒反應(yīng)及死亡情況，記錄每天體質(zhì)量，期間若有小鼠死亡，及時(shí)進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察心、肝、肺、腎、脾等器官，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。第14d所有小鼠摘眼球（頜下靜脈）取血，室溫靜置30min，3000rpm離心15min，取上層血清進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測(cè)，待動(dòng)物死亡后剖檢主要臟器并進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查，稱取主要臟器濕重，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重（mg）/體質(zhì)量（g）。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)：全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清ALT、AST、BUN、Cr含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠半數(shù)致死量（LD50）預(yù)實(shí)驗(yàn)：未觀察到動(dòng)物有急性毒性癥狀，根據(jù)小鼠給藥濃度為0.76g·ml-1，給藥體積 0.4ml/10g，其 LD50＞0.76g·ml-1，即 LD50＞30.4g/kg，因受小鼠給藥容積與藥物濃度的限制，未獲得小鼠的LD50值，遂以最大給藥劑量(30.4g·kg-1)進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。

3.2 給藥后小鼠癥狀觀察：溶媒組及給藥組小鼠灌胃給藥后均蜷縮1～2min后才開始正?；顒?dòng)，給藥后繼續(xù)觀察動(dòng)物行為2h，各組小鼠除給藥后1～2min活動(dòng)減少外，無(wú)其他異常表現(xiàn)。14d的觀察周期內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡，實(shí)驗(yàn)期間小鼠未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)癥狀，進(jìn)食、飲水、精神狀態(tài)及糞便均無(wú)異常。

3.3 給藥前后體質(zhì)量變化：連續(xù)14d每天同一時(shí)間稱重，觀察各組小鼠體質(zhì)量變化。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠平均體質(zhì)量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化（±s，g）

表1 三組小鼠給藥前后體質(zhì)量變化（±s，g）

組別 性別給藥后體質(zhì)量空白組溶媒組給藥組雌雄雌雄雌雄給藥前體質(zhì)量20.28±1.17 21.60±1.57 20.19±1.05 21.30±1.37 20.13±0.96 21.48±1.03第1天22.01±1.52 24.47±1.32 21.50±1.27 23.17±1.11 20.64±1.88 21.85±1.41第2天22.53±1.68 25.18±1.71 22.10±1.13 25.00±1.60 21.30±1.61 24.51±1.73第3天23.24±1.64 26.08±1.88 22.61±1.26 25.92±1.62 22.09±1.21 25.40±1.71第4天23.91±1.78 27.17±2.04 23.63±1.40 27.22±1.63 23.37±0.91 26.36±1.68第6天24.12±1.75 27.71±2.38 23.46±1.46 27.44±1.67 23.29±1.58 27.46±1.92第8天25.26±1.41 29.42±3.02 24.52±1.73 29.33±1.59 24.53±0.89 28.88±1.52第10天26.45±1.24 30.97±3.62 25.94±1.47 30.56±1.74 25.76±1.49 29.96±1.72第12天26.53±1.26 31.47±3.42 25.69±1.81 31.05±1.91 25.93±1.29 30.38±1.94第14天26.75±1.19 31.62±3.79 26.32±1.74 31.36±2.11 26.24±1.66 30.55±2.08

3.4 病理及臟器指數(shù)變化：給藥后第14天，頸椎脫臼并處死三組小鼠，進(jìn)行系統(tǒng)尸檢及HE染色，并與空白對(duì)照組進(jìn)行比較。由圖1可見(jiàn)小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞索和肝血竇向周圍呈放射狀排列，胞漿豐富。腎臟中腎小體結(jié)構(gòu)完整，腎小球位于小體中央且結(jié)構(gòu)完整。稱取各組小鼠臟器濕重，比較臟器指數(shù)變化，各組小鼠主要臟器指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 三組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較（±s）

表2 三組小鼠給藥后第14天臟器指數(shù)比較（±s）

組別空白組心肝脾性別雌性雄性雌性雄性雌性雄性肺腎溶媒組給藥組4.51±0.40 4.69±0.68 4.35±0.19 4.24±0.38 4.60±0.17 4.36±0.33 40.79±4.69 49.76±4.51 41.55±3.24 50.06±2.97 45.29±1.17 53.68±0.31 4.87±0.91 4.41±0.51 4.85±0.59 4.34±0.63 5.51±0.10 4.26±0.41 6.07±0.40 5.90±0.48 6.13±0.65 6.21±0.76 6.44±0.42 5.86±0.36 11.33±0.72 15.55±2.03 11.29±0.81 15.00±1.29 11.67±0.42 16.05±1.28胸腺2.98±0.61 1.90±0.41 3.09±0.51 2.17±0.31 3.34±0.54 2.09±0.55

圖1 小鼠肝腎組織病理切片(HE×400)

3.5 小鼠血液生化指標(biāo)變化：小鼠摘眼球（頜下靜脈）取血，室溫靜置30min，3000rpm離心15min，取上層血清檢測(cè)小鼠ALT、AST、BUN、Cr等指標(biāo)，結(jié)果表明三組小鼠的ALT、AST、BUN、Cr無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組小鼠給藥后血液學(xué)指標(biāo)（±s）

表3 三組小鼠給藥后血液學(xué)指標(biāo)（±s）

組別空白組溶媒組給藥組性別雌性雄性雌性雄性雌性雄性ALT（U·L-1）22.07±4.63 22.44±2.76 21.20±2.04 24.19±6.30 21.69±3.64 22.76±3.66 AST（U·L-1）76.55±19.27 63.94±17.50 76.11±6.16 63.33±15.30 72.67±12.70 61.49±8.13 BUN（mmol·L-1）5.06±0.66 6.11±1.30 5.16±0.80 5.41±0.56 5.26±1.55 5.59±0.71 Cr（μmol·L-1）14.01±1.57 16.32±2.66 12.97±1.50 14.96±1.40 13.04±1.64 13.99±1.27

4 討論

重樓生化湯系我院婦產(chǎn)科臨床應(yīng)用多年之經(jīng)驗(yàn)方，在生化湯（當(dāng)歸、川芎、桃仁、炮姜、炙甘草）基礎(chǔ)上加重樓、益母草、生黃芪而成，用于預(yù)防剖宮產(chǎn)術(shù)后惡露不絕，取得較好療效。中藥配方顆粒劑是傳統(tǒng)中藥飲片的改良劑型，具有方便攜帶、調(diào)配靈活、質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)[3]。中藥飲片制成配方顆粒劑后的藥效及其不良反應(yīng)的差異得到了許多學(xué)者的關(guān)注，如業(yè)康等[4]對(duì)姜半夏中藥配方顆粒、制草烏與飲片煎劑的急性毒性比較研究，發(fā)現(xiàn)姜半夏配方顆粒與飲片煎劑未見(jiàn)毒性，制草烏顆粒劑毒性明顯低于制草烏飲片煎劑的毒性。汪勤雙[5]對(duì)黃連解毒湯傳統(tǒng)飲片的湯劑與其配方顆粒劑的藥效學(xué)進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)配方顆粒湯劑對(duì)慢性胃炎合并發(fā)熱患者能改善癥狀，且起效快，但黃連解毒湯湯劑長(zhǎng)期療效相對(duì)較差，建議臨床可根據(jù)患者的實(shí)際情況選擇藥物治療。目前對(duì)傳統(tǒng)中藥飲片制成配方顆粒劑的臨床療效研究較多，但對(duì)于中藥配方顆粒劑的毒性研究則相對(duì)關(guān)注較少。

急性毒性實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)臨床用藥安全性的重要方法之一。本實(shí)驗(yàn)以重樓生化湯為基礎(chǔ)，研究重樓生化湯中藥配方顆粒的急性毒性，初步預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠以最大給藥量口服灌胃一次，小鼠狀態(tài)良好，未出現(xiàn)死亡情況，未獲得小鼠的LD50值，故選擇MAD試驗(yàn)法進(jìn)行重樓生化湯中藥配方顆粒的急性毒性實(shí)驗(yàn)。MAD實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重樓生化湯中藥配方顆粒對(duì)小鼠體質(zhì)量和主要臟器未產(chǎn)生明顯影響，各組小鼠的血液生化指標(biāo)也無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則，小鼠的最大耐受藥量大于成人臨床用藥量的100倍以上為安全[6]。根據(jù)重樓生化湯中藥配方顆粒每劑17.4g，成人按體質(zhì)量60kg計(jì)算，成人的給藥劑量是0.29g/kg/d，小鼠的最大給藥量是30.4g/kg/d，相當(dāng)于成人用量的105倍，提示重樓生化湯中藥配方顆粒毒性較低，值得臨床推廣。