伯克霍爾德氏菌JP2-270抗水稻紋枯病菌機理的初步研究

吳麗娟，韓 聰，王惠梅，王 磊，鄂志國

（中國水稻研究所，杭州 311401）

水稻OryzasativaL.是三大糧食作物之一，全球有接近一半的人口以稻米為食。隨著人口數(shù)量的不斷增長，對稻米的需求也在不斷增加。然而，水稻在生長過程中其產(chǎn)量不可避免地受到各種生物和非生物因素的影響，其中水稻病蟲害導(dǎo)致的減產(chǎn)占很大的比例。紋枯病是由立枯絲核菌Rhizoctoniasolani引起的一種破壞性土傳病害，從苗期至穗期都可發(fā)病，是水稻三大病害之一[1]。盡管對水稻種質(zhì)資源進行了大量篩選，但還沒有發(fā)現(xiàn)對紋枯病具有完全抗性的水稻品種，高抗性品種也很少見[1,2]。由于水稻的固有抗性水平低，目前不可能通過寄主抗性控制紋枯病的傳染。當(dāng)前，國內(nèi)外主要采用化學(xué)農(nóng)藥對其進行防治，但常年施用化學(xué)農(nóng)藥不僅造成環(huán)境污染、土壤板結(jié)等環(huán)境問題，還會促使病原菌產(chǎn)生抗性，使得防治難度加大，給農(nóng)業(yè)生態(tài)帶來嚴(yán)重的后果。此外，由于高溫高濕的環(huán)境有利于紋枯病菌的生長和侵染，而全球氣候變暖可能進一步增加該病害對水稻產(chǎn)量的損害風(fēng)險。因此，研究開發(fā)新的符合生態(tài)要求的方法防治水稻紋枯病是一項迫在眉睫的任務(wù)。目前，利用生防細(xì)菌防治植物病害是植物病害防治的主要策略之一，大多數(shù)的生防微生物來源于自然，對環(huán)境無污染、對非靶標(biāo)生物安全，現(xiàn)已成為防治水稻紋枯病的新途徑。在國內(nèi)外，許多研究者發(fā)現(xiàn)多種真菌和細(xì)菌對紋枯病菌具有很好的拮抗作用，例如：一株紫杉木霉ZJUF0986能夠有效防治水稻紋枯病[3]，芽胞桿菌Bacillusspp.、熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens和放線菌Actinomycetesspp.也有用于防治水稻紋枯病的報道[3-6]。近年來，對生防微生物的研究呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，而進一步研究生防菌的抑菌機理，對深化生防菌的應(yīng)用和開發(fā)新型微生物源農(nóng)藥具有重要意義。

伯克霍爾德氏菌Burkholderia廣泛分布于土壤、水體以及植物的根際中[7]。伯克霍爾德氏菌是一類重要的生防和促生細(xì)菌，所產(chǎn)生的胞外酶能夠溶解土壤中難溶性的磷，促進植物的生長[8,9]，還可產(chǎn)生對不同真菌病害具有抑制作用的多種次生代謝產(chǎn)物[10-12]。此外，伯克霍爾德氏菌在醫(yī)藥領(lǐng)域也具有重要的研究意義，所產(chǎn)生的代謝物具有抗細(xì)菌、抗病毒和抗腫瘤細(xì)胞等活性，是藥物先導(dǎo)化合物的重要資源[12,13]。近年來，對伯克霍爾德氏菌及其代謝物在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究不斷升溫，多種由伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)occidiofungin、gladiostatin、thailandepsins、pyrrolnitrin、pyoluteorin和AFC-BC11等相繼被發(fā)現(xiàn)和報道[10,12-16]。伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的天然代謝物，因來源于自然，對環(huán)境友好等特點，已經(jīng)越來越引起研究者的重視。伯克霍爾德氏菌不僅是國內(nèi)外生物防治研究的熱點，還是醫(yī)藥領(lǐng)域繼鏈霉菌之后微生物天然產(chǎn)物挖掘的又一重要資源。

本研究以一株分離自水稻根系土壤的伯克霍爾德氏菌JP2-270為對象，利用分子生物學(xué)等方法研究其抑制水稻紋枯病菌的機理，為進一步田間試驗提供技術(shù)支撐，同時也為遺傳改造該菌株提高其合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物的能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)條件

伯克霍爾德氏菌 JP2-270及其衍生菌株培養(yǎng)條件為 Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基），28 ℃。LB液體培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2，常規(guī)滅菌后使用。若為固體培養(yǎng)基，在滅菌前向其中添加瓊脂粉15 g/L。接一新鮮單菌落JP2-270 于3 mL LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，菌懸浮液保藏于20%甘油中，于－80 ℃冰箱長期凍存。每次活化JP2-270均從－80 ℃冰箱中取出，用無菌接種環(huán)挑取適量于LB固體培養(yǎng)基表面劃線。

試驗中用到的病原真菌生長條件為PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉10 g，pH 7.0，定容至1000 mL），28 ℃恒溫培養(yǎng)。

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基，37 ℃。

伯克霍爾德氏菌JP2-270發(fā)酵培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯酵母抽提（NBY，Nutrient broth yeast extract：蛋白胨10 g、牛肉浸粉3 g、酵母5 g、氯化鈉5 g，pH 7.0，定容至1000 mL），條件為28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

培養(yǎng)基中抗生素使用量為氨芐青霉素100 μg/mL，硫酸卡那霉素50 μg/mL，萘啶酮酸30 μg/mL?？股刭徲谏虾Ｉど锟萍加邢薰?。

本研究所用到的菌株和質(zhì)粒信息見表1。

1.2 菌株JP2-270抗真菌活性篩選及溫室盆栽防效試驗

采用平板對峙法進行菌株JP2-270抗真菌活性篩選[17]。將病原真菌（表2）提前在PDA固體培養(yǎng)基上進行活化。將菌株JP2-270于LB平板上活化后，挑取單菌落接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 h，然后取5 μL培養(yǎng)液滴加PDA培養(yǎng)基中心點兩側(cè)，距中心2.5 cm處，同時將活化好的病原真菌用6 mm打孔器沿著菌絲邊緣打取一個菌餅，然后將菌餅的菌絲面朝下，接種到已經(jīng)接種有供試菌JP2-270的PDA培養(yǎng)基中央，接種5個平板作為重復(fù)。以不接供試菌JP2-270而只接種病原菌的平板為對照。在28 ℃下進行對峙培養(yǎng)，培養(yǎng)2～7 d觀察并記錄抑菌圈半徑，計算抑制率，抑制率（%）＝（對照菌落半徑－處理菌落半徑）/（對照菌落半徑－菌餅半徑）×100。

以水稻品種lement為材料，對水稻紋枯病的溫室盆栽防治效果進行研究。水稻種子于28 ℃環(huán)境中浸泡催芽，3 d后將發(fā)芽的種子種植到裝有盆栽土壤的塑料托盤中（23 cm×16 cm×6 cm）。水稻植株在常規(guī)溫室條件下生長（光照12 h，25 ℃±5 ℃）。待生長至分蘗期，用1×108CFU/mL的含細(xì)胞發(fā)酵液噴施水稻植株，24 h后用牙簽固定一塊紋枯病菌 GD118 菌餅（0.6 cm）于每一個植株的葉鞘處。空白對照處理噴施等量無菌 NBY培養(yǎng)基（液）。陽性對照處理噴施10%井岡霉素水劑（浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司）。所有處理接種 20株植物作為重復(fù)。調(diào)節(jié)溫室空氣濕度，保持相對濕度在 90%。接種7 d后，測量病斑長度，計算抑制率，抑制率（%）=（空白對照的平均病斑長度—各處理平均病斑長度）/空白對照的平均病斑長度×100。

1.3 基因敲除及回補

1.3.1 基因敲除載體構(gòu)建 利用同源重組法構(gòu)建無標(biāo)記基因框內(nèi)缺失突變體，所用載體為pK18mobSac[18]。使用在線引物設(shè)計軟件 primer 3，根據(jù)伯克霍爾德氏菌 JP2-270基因組中硝吡咯菌素合成基因prnC（GeneBank登錄號CP029828中的DM992_38825基因）及其上下游序列，設(shè)計擴增上游同源臂引物prnCupF（5′-TCAGCGGCAAAGTTCATGAC-3′）/prnCupR（5′-AATCAACAGTTTCGCGTGCTGATCATCAACTC GAAGTACAGCCTGCT-3′）和下游同源臂引物 prnCdwF（5′-GATGATCAGCACGCGAAACT-3′）/ prnCdwR（5′-CGCCGGAAATCCTGTAGTG-3′）；類似地，根據(jù)抗真菌糖肽occidiofungin合成基因ocfE（GeneBank登錄號 CP029828中的 DM992_3338基因）及其上下游序列，設(shè)計擴增上游同源臂引物 ocfEupF（5′-GACGCATACCTGTTCAGCTG-3′）/ocfEupR（5′-CCAGCGGATAGTGCGCATAGTCCTCCTGCCACT GTTTCACCAAAGCC-3′）和下游同源臂引物 ocfEdwF（5′-CAGGAGGACTATGCGCACTA-3′）/ocfEdwR（5′-CGAAGAAGTGGAGATTGCCG-3′）；根據(jù)劍蘭制霉菌素gladiostatin合成基因gdsE（GeneBank登錄號CP029828中的DM992_38920基因）及其上下游序列，設(shè)計擴增上游同源臂引物gdsEupF（5′-TCTAGAG CCGAACATGCTGTCGTATT-3′）/gdsEupR（5′-GGCCGGCGAGATGTGGAAGAACGCGGCATCTACCTC GTACCAGCAGC-3′）和下游同源臂引物 gdsEdwF（5′-GCCGCGTTCTTCCACATCT-3′）/ gdsEdwR（5′-AAG CTTTCCTCTCCATTTACTCGCCG-3′）。

PCR 反應(yīng)體系：2×KOD One PCR Master Mix（TOYOBO）25 μL，正向引物（10 mmol/L）1 μL，反向引物（10 mmol/L）1 μL，模板 0.5 μL（約 50 ng DNA），ddH2O 補足 50 μL。

PCR反應(yīng)程序如下：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，此過程進行35個循環(huán)；之后延伸10 min。所使用PCR儀器為伯樂 Bio-Rad T100。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，在紫外光下分別切下所擴增的目的條帶，用愛思進Axygen DNA凝膠回收試劑盒（AP-GX-50）進行膠回收處理，純化后的基因片段命名為prnCup和prnCdw、ocfEup和ocfEdw、gdsEup和gdsEdw，可立即使用或于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)同源重組的原理，用ClonExpress II One Step Cloning Kit（C112-01，諾唯贊）試劑盒，將純化后的基因片段prnCup和prnCdw，ocfEup和ocfEdw，gdsEup和gdsEdw，按順序同時連接至線性化載體pK18mobSacB上，構(gòu)建基因敲除載體。按照說明書配制連接反應(yīng)體系，將配好的連接反應(yīng)體系輕輕混勻，37 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上冷卻數(shù)秒。之后可將重組產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆没蛑苯佑糜谵D(zhuǎn)化。

上述重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α（碧云天）感受態(tài)細(xì)胞。采用熱激法轉(zhuǎn)化，從轉(zhuǎn)化篩選平板上隨機挑取若干單菌落作為模板，以載體上的引物M13F（5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′）和M13R（5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）進行 PCR，驗證兩個插入片段是否按順序同時插入到線性化的pK18mobSacB載體中。將PCR擴增結(jié)果為陽性的單菌落接種至含卡那霉素抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于 37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，菌液直接送公司測序，將序列完全正確的質(zhì)粒定名為 pK18-prnC、pK18-ocfE和pK18-gdsE，保存質(zhì)粒進行下一步操作。

1.3.2 菌株JP2-270基因敲除突變株的構(gòu)建 采用電轉(zhuǎn)化法，將pK18-prnC、pK18-ocfE和pK18-gdsE分別轉(zhuǎn)入S17-1（λpir+）感受態(tài)細(xì)胞中。然后利用雙親結(jié)合法，將pK18-prnC、pK18-ocfE和pK18-gdsE分別轉(zhuǎn)入菌株JP2-270中。首先通過卡那霉素和萘啶酮酸抗性的篩選獲得成功轉(zhuǎn)入的伯克霍爾德氏菌單交換突變株，經(jīng)過再次抗性驗證后進行無抗性的松弛培養(yǎng)。松弛培養(yǎng) 6～8代后，取一定量的菌液進行梯度稀釋，后涂鋪于無抗生素的 LB平板上。待單克隆長出后，用牙簽挑取單克隆，同時劃線接種于含卡那霉素抗性的LB平板和無抗性平板上（兩個板上的克隆要一一對應(yīng)），28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取在含卡那霉素抗性平板上不生長而無抗性平板上生長的菌落進行PCR驗證，引物使用T-prnCF（5′-ACGTCCTGCCGGTAGT AATG-3′）和 T-prnCR（5′-TTACGCCTACCGCTTCATCT-3′）、T-ocfEF（5′-CGGCCTGTTCATCAATACG G-3′）和 T-ocfER（5′-GGAAGATGAGCAGGCTTTCG-3′）、T-gdsEF（5′-GCCGAACATGCTGTCGTATT-3′）和 T-gdsER（5′-GTGCACGTCGAGGAAGAAC-3′），以基因敲除載體（pK18-prnC、pK18-ocfE和 pK18-gdsE）和菌株JP2-270基因組分別為陽性和陰性對照，擴增片段大小與載體擴增片段大小一致的為正確的雙交換突變株，而擴增片段大小與基因組大小一致的為回復(fù)突變株。獲得的雙交換突變株定名為 ΔprnC、ΔocfE和 ΔgdsE。

1.3.3prnC基因回補質(zhì)粒的構(gòu)建 選擇載體 pBBR1MCS-2，使用 C-prnCF（5′-CTACTTCAGCGCCAA GCC-3′）和C-prnCR（5′-TCTGCAGAAAATGGTCGAATC-3′）引物擴增prnC完整基因及其上游601 bp的區(qū)域（含prnC啟動子區(qū)），按照1.3.1所述方法，構(gòu)建回補prnC基因的回補載體pBBR2-prnC。

1.3.4prnC回補菌株的構(gòu)建 按照1.3.2所述方法，將pBBR2-prnC轉(zhuǎn)入ΔprnC中，經(jīng)過抗性驗證成功的菌落克隆即為ΔprnC中成功回補了prnC基因的菌株，命名為ΔprnC+pBBR2-prnC。

1.4 RNA提取及熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

菌株JP2-270（WT）和框內(nèi)bysR缺失突變株（ΔbysR前期研究中已構(gòu)建），在LB平板上活化，挑取單克隆接至3 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。次日，將培養(yǎng)液按照1% 接種量接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，立刻凍于-80 ℃冰箱備用或直接進行RNA提取。RNA提取采用細(xì)菌RNA提取試劑盒（DP430，北京天根生物科技有限公司），按照說明書制備總 RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析其質(zhì)量和濃度。用gDNA去除劑（TOYOBO，東洋紡）在37 ℃下消化基因組DNA（gDNA）5 min，用逆轉(zhuǎn)錄酶Ace qPCR RT Master Mix（TOYOBO，東洋紡）將總RNA（約1 μg）轉(zhuǎn)化為cDNA。將樣品稀釋，在PCR體系中加入約50 ng cDNA，總體積為20 μL，使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO，東洋紡）進行定量PCR（qPCR）。反應(yīng)體系為：2×SYBR qPCR Mix 10 μL，10 mmol/L 正向引物 0.4 μL，10 mmol/L 反向引物 0.4 μL，50×ROX 0.02 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃ 變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)；反應(yīng)在Applied Biosystems 7500儀器上進行，按說明進行設(shè)置。以recA基因為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法測定prnA和prnC基因的相對表達(dá)量。檢測prnA基因相對表達(dá)量的引物為qRT-prnAF（5′-TCCGTTCA ACCAGAAGTTCC-3′）和 qRT-prnAR（5′-GCCATCAAGGAAAAGGTTC A-3′），檢測prnC基因相對表達(dá)量的引物為 qRT-prnCF（5′-GATGTCCGTTTTCGGGTAGA-3′）和 qRT-prnCR（5′-CGACGACATCTTCAAG GTCA-3′），內(nèi)參recA基因的擴增引物為 qRT-recAF（5′-CGG CTCAATCAAGAAGAACG-3′）和 qRT-recAR（5′-AGATGCCCTCGCCATACAG-3′）。

1.5 高效液相色譜（HPLC）分析

使用NBY液體培養(yǎng)基對供試菌株進行發(fā)酵，發(fā)酵周期為72 h。發(fā)酵液（含細(xì)胞）按照1:1.2比例加入乙酸乙酯進行萃取，室溫萃取4 h后，取有機相進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，沉淀物用色譜級的甲醇溶液溶解后，用0.22 μm有機濾膜過濾。過濾后所得即為發(fā)酵液粗提物，粗提物可直接進行高效液相色譜分析或保存與-20 ℃?zhèn)溆?。色譜分析條件：使用安捷倫色譜柱Agilent Zorbax SB-C18，長度 250 mm×9.2 mm，粒徑 5 μm；流動相使用甲醇水梯度混合液，即從90%水和10%甲醇混合液開始，30 min內(nèi)甲醇濃度梯度升至100%，檢測波長為220 nm。高效液相色譜分析在安捷倫1260儀器上進行，按照儀器說明設(shè)置程序和參數(shù)。所用流動相均為色譜級的水和色譜級的有機溶劑。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析和作圖在Microsoft Excel 2010中進行。T檢驗用于比較兩組數(shù)據(jù)間的差異，當(dāng)P＜0.05時，有顯著性差異，當(dāng)P＜0.01時，有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株JP2-270抗真菌活性

采用平板對峙生長法對菌株JP2-270的抑菌譜進行測定結(jié)果表明，菌株JP2-270除了對水稻紋枯病菌具有抑制活性外，對水稻稻瘟病菌不同生理小種（Guy11和B157）、大豆菌核病、香蕉枯萎病、番茄斑枯病、小麥赤霉病和煙草枯萎病等病原真菌物均具有不同程度的抑制作用，表明菌株JP2-270具有廣譜抑菌活性（表2）。

2.2 菌株JP2-270發(fā)酵液對水稻紋枯病防治效果

溫室盆栽試驗結(jié)果表明，菌株JP2-270對水稻紋枯病菌具有較好的預(yù)防效果。只噴施無菌NBY培養(yǎng)液的對照葉片接種紋枯病菌后所產(chǎn)生的平均病斑長度為（7.00±1.25）cm；經(jīng)過菌株 JP2-270發(fā)酵液處理的水稻葉片，紋枯病菌侵染產(chǎn)生的病斑長度平均為（0.75±0.50）cm，與對照相比有極顯著差異，抑制率達(dá)89.36%；經(jīng)井岡霉素處理的葉片平均病斑長度為（0.51±0.20）cm，與對照相比有極顯著差異，抑制率為92.79%（圖1，表3）。菌株JP2-270發(fā)酵液處理對水稻紋枯病菌的防治效果與井岡霉素處理無顯著差異（P=0.057）。

圖1 菌株JP2-270發(fā)酵液和井岡霉素抑制水稻紋枯病菌活性Fig.1 The inhibitory activity of JP2-270 fermentation broth and Jinggangmycin against R.solani GD118

表3 菌株JP2-270 發(fā)酵液抑制紋枯病菌活性Table 3 The control efficacy of JP2-270 fermentation broth against rice sheath blight

2.3 菌株 JP2-270抑制紋枯病菌活性物質(zhì)硝吡咯菌素pyrrolnitrin的測定結(jié)果

根據(jù)菌株JP2-270基因組，利用antiSMASH軟件預(yù)測了菌株JP2-270的次生代謝物合成基因簇信息，菌株 JP2-270基因組上含有與硝吡咯菌素pyrrolnitrin、抗真菌糖肽 occidiofungin和劍蘭制霉菌素gladiostatin合成基因簇高度同源的基因簇（未發(fā)表數(shù)據(jù)），即NCBI 基因登錄號CP029826中的基因DM992_38820-DM992_38835對應(yīng)硝吡咯菌素合成基因簇；基因DM992_33325-DM992_33410對應(yīng)抗真菌糖肽合成基因簇；基因DM992_38890-DM992_38940對應(yīng)劍蘭制霉菌素合成基因簇。

為了明確菌株JP2-270產(chǎn)生抑制紋枯病菌的代謝物，對上述3個已知代謝物合成基因簇中的關(guān)鍵基因進行靶向敲除，通過比較各突變株的抑菌活性差異尋找活性代謝物合成基因簇結(jié)果顯示，當(dāng)硝吡咯菌素合成基因簇中的prnC基因敲除后，受菌株ΔprnC抑制的真菌生長半徑為（2.30±0.10）cm，受野生型菌JP2-270抑制的菌絲生長半徑為（1.16±0.05）cm，兩組數(shù)據(jù)間T檢驗P＜0.01，表明突變菌株ΔprnC抑制紋枯病菌活性，與野生型菌株JP2-270相比明顯降低，具有極顯著差異。而抗真菌糖肽 occidiofungin的合成基因簇中關(guān)鍵基因ocfE發(fā)生突變后，受突變菌株ΔocfE抑制的紋枯病菌菌絲生長半徑為（2.11±0.11）cm，受對照野生菌株JP2-270抑制的菌絲生長半徑為（1.98±0.08）cm，兩組數(shù)據(jù)間T檢驗P＞0.05（P=0.074），表明菌株ΔocfE抑制紋枯病菌活性與野生型菌株JP2-270相比略有下降，但無顯著差異。并且劍蘭制霉菌素gladiostatin合成基因簇中的聚酮合酶基因gdsE靶向缺失后，受突變菌株ΔgdsE抑制的紋枯病菌菌絲生長半徑與受野生型菌株JP2-270抑制的菌絲生長半徑分別為（1.29±0.12）和（1.16±0.05）cm，兩組數(shù)據(jù)間T檢驗P＞0.05（P=0.065），表明菌株ΔgdsE抑制紋枯病菌活性比菌株 JP2-270略有降低，但無顯著差異（圖2）。同時，在ΔprnC中回補完整的prnC基因后，菌株ΔprnC＋pBBR2-prnC能夠恢復(fù)野生型菌株JP2-270的抑制活性，且ΔprnC抑制紋枯病菌的活性并不能被空載體pBBR1MCS-2所恢復(fù)（圖3）。由此可見，硝吡咯菌素合成基因簇所負(fù)責(zé)合成的硝吡咯菌素是菌株JP2-270產(chǎn)生抑制水稻紋枯病菌的主要活性代謝物。

圖2 菌株JP2-270各突變菌株抑制紋枯病菌活性Fig.2 Inhibitory activity of JP2-270 derivatives against R.solani GD118

圖3 菌株ΔprnC+pBBR2-prnC和ΔprnC+pBBR2抑菌活性Fig.3 Inhibitory activity of ΔprnC+pBBR2-prnC and ΔprnC+pBBR2 against R.solani GD118

2.4 BysR在轉(zhuǎn)錄水平上正調(diào)控硝吡咯菌素pyrrolnitrin的合成

BysR屬于LysR類型轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，根據(jù)前期研究結(jié)果，推測BysR蛋白能夠調(diào)控硝吡咯菌素合成基因簇prn的表達(dá)，來調(diào)控硝吡咯菌素的合成，進而發(fā)揮抑制水稻紋枯病菌活性。為了證實該假設(shè)，本研究以recA基因為內(nèi)參，采用qRT-PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上分析硝吡咯菌素合成基因簇是否受到BysR調(diào)控蛋白的調(diào)控。硝吡咯菌素合成基因簇由prnA、prnB、prnC和prnD四個基因組成，本研究選取其中prnA和prnC來檢測其表達(dá)量如圖4所示，與野生型菌株JP2-270相比，在bysR基因突變菌株ΔbysR中，prnA和prnC基因的表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)，說明BysR調(diào)控蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控硝吡咯菌素合成基因簇的表達(dá)，從而調(diào)控硝吡咯菌素的合成。

圖4 硝吡咯菌素合成基因prnA和prnC相對表達(dá)量Fig.4 Relative gene expression of pyrrolnitrin synthetic gene prnA and prnC

2.5 HPLC差異代謝物分析

為了從代謝物合成水平上驗證BysR調(diào)控蛋白能夠調(diào)控硝吡咯菌素的合成，本研究比較了菌株JP2-270和ΔbysR所產(chǎn)生的次生代謝物差異。首先菌株JP2-270、ΔbysR和bysR回補菌株分別用NBY培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，72 h后將發(fā)酵產(chǎn)物進行乙酸乙酯抽提、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到粗提物。然后和硝吡咯菌素標(biāo)準(zhǔn)品（sigma）一起進行高效液相色譜分析。如圖5A所示，硝吡咯菌素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間在22.203 min，菌株JP2-270的粗提物在22.206 min有一個明顯的物質(zhì)峰，與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間幾乎一致，說明菌株JP2-270的代謝產(chǎn)物中存在硝吡咯菌素。而 ΔbysR菌株在相應(yīng)時間沒有對應(yīng)的物質(zhì)峰，表明bysR缺失突變后導(dǎo)致菌株不能合成硝吡咯菌素。為了進一步證實bysR直接參與硝吡咯菌素的合成，分析了菌株 JP2-270、ΔbysR和bysR回補菌株（ΔbysR+pBBR-bysR，前期研究已構(gòu)建）代謝物合成差異，如圖 5B所示，硝吡咯菌素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為23.090 min，野生型菌株JP2-270和bysR回補菌株（ΔbysR+pBBR-bysR）的發(fā)酵粗提物分別在23.086和23.099 min處能檢測到明顯的物質(zhì)峰，與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間幾乎一致，說明bysR基因的回補能夠恢復(fù)bysR基因突變株ΔbysR合成硝吡咯菌素的能力。綜合以上結(jié)果，BysR調(diào)控蛋白與硝吡咯菌素的合成相關(guān)，對硝吡咯菌素的合成起正調(diào)控作用。

圖5 菌株JP2-270及衍生菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果圖Fig.5 HPLC analysis of fermentation broth of JP2-270 and derivatives

3 討論

土壤中有益微生物資源的挖掘是更好發(fā)揮生物防治優(yōu)勢的前提，假單胞菌一直被認(rèn)為是植物根際細(xì)菌中抑制病菌的最重要類群之一，也是研究最為深入的一類土壤細(xì)菌。然而，土壤中的另一大類群伯克霍爾德氏菌同樣具有很好的生防潛能和多種代謝物合成的能力，近年來也越來越引起人們的關(guān)注。本研究前期從中國水稻研究所基地水稻根系土壤中分離到一株細(xì)菌JP2-270，抑菌活性顯示無論在平板上還是在水稻葉片上都表現(xiàn)出很好的抑制水稻紋枯病菌活性（圖1）。伯克霍爾德氏菌屬的多個種已經(jīng)有作為生防菌群的研究報道，如吡咯伯克霍爾德氏菌BurkholderiapyrrociniaLyc2已報道具有抗細(xì)菌的活性[19]，而該種的另一株菌 BRM 32113能夠誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性，降低水稻葉瘟的嚴(yán)重程度[20]，洋蔥伯克霍爾德菌BurkholderiacepaciaR-12632產(chǎn)生的硫化聯(lián)踔酚酮（ditropolonyl sulfide）具有抗細(xì)菌活性[21]，洋蔥伯克霍爾德菌CQ18同時具有抗病和溶磷的能力，能夠調(diào)節(jié)土壤生態(tài)微環(huán)境[22]。

本研究中的伯克霍爾德氏菌具有抗水稻紋枯病菌的生防潛能，為了對其更好地加以利用，通過分子生物學(xué)的研究方法初步探討了其抑制紋枯病菌的機理。伯克霍爾德氏菌具有大而復(fù)雜的基因組，通常具有2個環(huán)形染色體和0～6個質(zhì)粒，平均大小約7.5 Mb[23]，這樣相對復(fù)雜的基因組為伯克霍爾德氏菌強大的代謝潛能提供了基礎(chǔ)。前期的研究已經(jīng)揭示 JP2-270基因組由 3個染色體和 2個質(zhì)粒組成，總的大小為8925310 Mb，共編碼8193個蛋白[24]。本研究通過antiSMASH在線分析軟件對JP2-270基因組中次生代謝物合成基因簇進行分析，預(yù)測到了3個與已知代謝物合成基因簇高度同源的基因簇，即硝吡咯菌素合成基因簇（pyrrolnitrin）prnA-D，抗真菌糖肽（occidiofungin）合成基因簇ocfA-N和劍蘭制霉菌素（gladiostatin）合成基因簇gdsA-I。硝吡咯菌 pyrrolnitrin是一種常見的具有廣譜抗菌活性的代謝物，通常由假單胞菌Pseudomonas、沙雷氏菌Serratia和伯克霍爾德氏菌Burkholderia的一些種所產(chǎn)生[25]。抗真菌糖肽occidiofungin是由洋蔥伯克氏菌MS14產(chǎn)生的一種糖脂肽類物質(zhì)，由8個氨基酸和一個木糖組成，具有廣譜的抗植物和動物病原真菌的活性[16]；劍蘭制霉菌素gladiostatin是新分離鑒定到的戊二酰亞胺聚酮類化合物，具有抗腫瘤細(xì)胞的活性[13]。通過基因敲除及抗性篩選，發(fā)現(xiàn)硝吡咯菌素合成基因簇的缺失突變導(dǎo)致菌株JP2-270抑制紋枯病的活性明顯降低，而抗真菌糖肽合成基因簇和劍蘭制霉菌素合成基因簇的缺失對菌株JP2-270抑制紋枯病菌活性的影響較小，由此認(rèn)為菌株JP2-270產(chǎn)生的硝吡咯菌素是抑制水稻紋枯病菌的主要活性代謝物。硝吡咯菌素pyrrolnitrin具有抗水稻紋枯病菌活性的發(fā)現(xiàn)是可預(yù)見的結(jié)果，然而硝吡咯菌素合成調(diào)控的研究還比較少，在伯克霍爾德氏菌和沙雷氏菌，已有的研究報道顯示硝吡咯菌素的合成是受群體感應(yīng)系統(tǒng)所調(diào)控的[26,27]，在綠針假單胞菌PseudomonaschlororaphisG05中有報道一種LysR類型轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白FinR能調(diào)控pyrrolnitrin的合成[28]。

LysR類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（LysR-type transcription regulators，LTTRs）是原核生物中最常見的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，可以作為基因表達(dá)的激活劑或抑制因子[29-31]。LTTRs能夠調(diào)控多種基因表達(dá)，包括根瘤菌的共生固氮相關(guān)基因、細(xì)菌致病性相關(guān)基因、代謝相關(guān)基因、群體感應(yīng)和運動性相關(guān)基因的表達(dá)，是一種全局性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白[32]。目前在多種菌屬中都發(fā)現(xiàn) LTTRs能夠誘導(dǎo)或抑制次生代謝物的合成，如天藍(lán)色鏈霉菌Streptomycescoelicolor中的 StgR通過與途徑特異性調(diào)控因子的相互作用抑制 actinorhodin和prodigiosin的合成[33]，泰國假單胞桿菌Burkholderiathailandensis的ScmR對多種次生代謝物的合成起正向和反向的調(diào)控作用[34]，假單胞桿菌Pseudomonassp.M18中的PqsR抑制藤黃綠膿菌素（pyoluteorin）合成的同時，能夠激活吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid）的合成[35]。LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在假單胞菌中的研究比較詳盡，而在伯克霍爾德氏菌Burkholderia中的研究相對較少，且主要集中于致病性伯克霍爾德氏菌的生物膜形成、致病性、菌落形態(tài)和群體感應(yīng)等方面[36-39]。該家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在伯克霍爾德氏菌中參與次生代謝物合成調(diào)控的研究目前報道的僅有ScmR和ShvR兩個調(diào)控因子[34,40]。前期研究已經(jīng)通過Tn5轉(zhuǎn)座子隨機誘變發(fā)現(xiàn)了一個新的LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BysR，并證實該調(diào)控因子與JP2-270抑制病原真菌的活性相關(guān)[24]。為了探討該蛋白是否調(diào)控硝吡咯菌素的合成，進而控制菌株JP2-270抑制水稻紋枯病菌活性，本研究從轉(zhuǎn)錄水平和代謝物合成水平上分析了突變菌株ΔbysR和野生型菌株JP2-270的基因表達(dá)和代謝物合成差異。試驗結(jié)果證實BysR調(diào)控蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控硝吡咯菌素合成基因簇的表達(dá)，進而調(diào)控硝吡咯菌素的合成，BysR調(diào)控蛋白對硝吡咯菌素的合成起正調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)的BysR蛋白屬于LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，對硝吡咯菌素的合成具有正向調(diào)控作用，與其他伯克霍爾德氏菌報道的硝吡咯菌素的合成受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控不一致。另外，雖然本研究中的BysR蛋白也屬于LysR家族，但是該蛋白來源于伯克霍爾德氏菌，與來源于假單胞菌的FinR蛋白的同源性較低，可能BysR對硝吡咯菌素的合成調(diào)控模式不同于FinR蛋白。此外，根據(jù)本研究室還未公開發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，菌株JP2-270中一群體感應(yīng)信號也影響了硝吡咯菌素的合成，且該群體感應(yīng)信號基因的表達(dá)同時也受到BysR調(diào)控蛋白的調(diào)控，推測BysR調(diào)控蛋白可能通過影響該群體感應(yīng)系統(tǒng)，進而影響硝吡咯菌素合成基因簇的表達(dá)。然而，目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白BysR作用機制的研究工作尚處于起步階段，因此菌株JP2-270中BysR蛋白對硝吡咯菌素的合成是起直接調(diào)控作用還是間接調(diào)控作用，還有待繼續(xù)深入研究。

伯克霍爾德氏菌中 BysR調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。首先，BysR調(diào)控硝吡咯菌素 pyrrolnitrin的合成在伯克霍爾德氏菌中是一個新的發(fā)現(xiàn)，這能夠豐富pyrrolnitrin代謝物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其次，未公開的RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)BysR還調(diào)控多種代謝物的合成，BysR調(diào)控蛋白在挖掘新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物研究方面也具有十分重要的意義。最后，BysR調(diào)控蛋白可以作為基因工程改良的靶點，為菌株的遺傳改造提供理論依據(jù)，也為生物防治水稻紋枯病等各種真菌病害提供新的可靠方法。

致謝：感謝國家自然科學(xué)基金給予的資助；感謝中國水稻研究所國家重點實驗室提供的實驗平臺；感謝中國水稻研究所黃世文老師提供的水稻紋枯病菌和中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的病原真菌。